ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................... 5
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................... 17
2.1 Общие сведения об использовании искусственного осеменения в
современном животноводстве ........................................................................ 17
2.2 Современное состояние рынка спермопродукции .................................. 19
2.3 Риски использования технологии искусственного осеменения ............. 20
2.4 Инфекционные агенты, выявляемые в племенном материале КРС ....... 21
2.4.1 Общие сведения .................................................................................. 21
2.4.2 Герпесвирусы КРС.............................................................................. 23
2.4.3 Вирус диареи КРС .............................................................................. 35
2.4.4 Вирус Шмалленберг ........................................................................... 41
2.4.5 Вирус Блютанга .................................................................................. 45
2.4.6 Микоплазмы и уреаплазмы КРС........................................................ 48
2.4.7 Кампилобактерии................................................................................ 57
2.4.8 Бруцеллы............................................................................................. 61
2.4.9 Хламидии ............................................................................................ 64
2.4.10 Лептоспиры....................................................................................... 68
2.4.11 Коксиеллы......................................................................................... 71
2.4.12 Гистофилы Histophilus somni ........................................................... 75
2.5 Использование молекулярно-генетических методик и ПЦР-тест-систем при
выявлении инфекционных агентов в сперме................................................. 81
2.6 Требования к спермопродукции в разных странах ................................. 90
2.7 Заключение к обзору литературы............................................................. 91
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .......................................... 94
3.1 Биологический материал, использованный в работе .............................. 94
3.2 Реактивы, препараты, среды и наборы реагентов ................................... 94
3.3 Оборудование для молекулярно-генетических исследований ............. 100
3.4 Микробиологические исследования ...................................................... 101
3.5 Вирусологические исследования ........................................................... 102
3.6 Экстракция нуклеиновых кислот и обратная транскрипция ................ 103
3.7 Подбор праймеров и зондов для ПЦР.................................................... 103
3.8 Проведение ПЦР ..................................................................................... 104
3.9 Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК методом
капиллярного электрофореза (по Сенгеру) ................................................. 105
3
3.10 Получение положительных контрольных образцов............................ 106
3.11 Проведение секвенирования «нового поколения» .............................. 106
3.12 Математические расчеты...................................................................... 108
4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.............................................................. 110
4.1 Анализ современного состояния контроля биобезопасности племенного
материала....................................................................................................... 110
4.2 Оценка возможности использования ПЦР-тест-систем, предназначенных для
диагностики болезней КРС, для тестирования спермопродукции............. 114
4.3 Скрининговое исследование спермы быков для выявления вирусных
инфекционных агентов ................................................................................. 122
4.4 Вирусологическое исследование образцов спермы КРС...................... 123
4.5 Поиск новых вирусных контаминантов спермы быков ........................ 125
4.6 Разработка способа выявления ДНК BHV-6 в сперме быков методом ПЦР в
режиме «реального времени»....................................................................... 128
4.7 Скрининговое исследование спермы быков для выявления бактериальных
инфекционных агентов ................................................................................. 131
4.7.1 Результаты выявления Campylobacter spp....................................... 132
4.7.2 Выявление Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus spp.
.................................................................................................................... 132
4.7.3 Выявление Coxiella burnetii.............................................................. 133
4.7.4 Выявление Histophilus somni............................................................ 134
4.8 Разработка методики выявления ДНК H. somni на основе ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в
режиме «реального времени»....................................................................... 135
4.9 Изучение свойств культур H. somni, выделенных из различного
биологического материала ........................................................................... 140
4.10 Выявление генов устойчивости к антибиотикам изолятов H. somni.. 142
4.11 Сравнительный анализ полных геномов изолятов H. somni............... 148
4.12 Выявление микроорганизмов рода Mycoplasma.................................. 156
4.13 Разработка методик выявления ДНК Mycoplasma bovis, M. californicum,
M. bovigenitalium и Ureaplasma diversum на основе ПЦР с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»...................... 158
4.14 Определение жизнеспособности микоплазм ....................................... 167
4.15 Изучение метагенома образцов спермы быков ................................... 168
4
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................. 178
6 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................. 192
7 РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
........................................................................................................................... 198
8 ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ............................. 201
9 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................. 204
10 ПРИЛОЖЕНИЯ........................................................................................... 280
