Оглавление
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ .................................................................. 5
ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................................................... 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................................... 14
1.1. Источники свободных радикалов аминокислот и аминокислотных остатков триптофана и
тирозина in vivo ......................................................................................................................................... 14
1.1.1. АФК и окислительный стресс ..................................................................................................... 14
1.1.2. Образование радикалов триптофана и тирозина под действием УФ излучения ....................... 16
1.2. Продукты радикального повреждения аминокислотных остатков триптофана и тирозина in vivo 19
1.2.1. Кросс-сшивки .............................................................................................................................. 19
1.2.2. Оксигенированные формы .......................................................................................................... 21
1.3. Ткань хрусталика глаза как удобная модель для исследования последствий радикальных реакций
................................................................................................................................................................... 22
1.3.1. Строение хрусталика ................................................................................................................... 23
1.3.2. Состав ткани хрусталика ............................................................................................................. 24
1.3.3. Физико-химические свойства среды ткани хрусталика ............................................................. 27
1.4. Фотохимические свойства кинуренинов и продуктов их термического разложения ...................... 27
1.4.1. Фотохимические свойства кинуренинов .................................................................................... 27
1.4.2. Термическая нестабильность кинуренинов и их фотохимически активные продукты............. 30
1.4.3. Спектральные и фотохимические свойства кинуреновой кислоты в основном и возбужденном
триплетном состоянии .......................................................................................................................... 31
1.4.4. Кинуреновая кислота как компонент антиоксидантной защиты клеток ................................... 34
1.5. Механизмы и продукты реакций радикала триптофана в модельных средах .................................. 35
1.5.1. Внутримолекулярный перенос электрона в цепи аминокислотных остатков триптофана и
тирозина ................................................................................................................................................ 35
1.5.2. Образование кросс-сшивок между остатками триптофана ........................................................ 36
1.5.3. Образование оксигенированных форм триптофана ................................................................... 39
1.5.4. Образование ковалентных сшивок триптофана с молекулами фотосенсибилизаторов ............ 43
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................ 45
2.1. Используемые реагенты ..................................................................................................................... 45
2.2. Оптическая спектроскопия ................................................................................................................ 45
2.3. Лазерный импульсный фотолиз ......................................................................................................... 46
2.4. Стационарный фотолиз ...................................................................................................................... 47
2.5. Импульсный фотолиз ......................................................................................................................... 47
2.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография с оптическим детектированием (ВЭЖХ-УФ) ... 47
2.7. Расчёт квантовых выходов фоторазложения исходных реагентов ................................................... 48
2.8. Анализ ферментативной активности лизоцима................................................................................. 49
2.9. Ферментативный гидролиз HEWL .................................................................................................... 49
3
2.10. Масс-спектрометрия......................................................................................................................... 49
2.11. Гель-электрофорез ............................................................................................................................ 50
ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ МЕЖДУ ТРИПЛЕТНЫМ СОСТОЯНИЕМ КИНУРЕНОВОЙ КИСЛОТЫ И АМИНОКИСЛОТОЙ ТРИПТОФАН ................................................................................... 52
3.1. Выбор экспериментальных условий .................................................................................................. 52
3.2. Установление механизма реакции между 3KNAH— и TrpH.............................................................. 53
Заключение по материалам главы 3 ......................................................................................................... 60
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ pН НА МЕХАНИЗМЫ И ПРОДУКТЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННЫХ РЕАКЦИЙ МЕЖДУ КИНУРЕНОВОЙ КИСЛОТОЙ И АМИНОКСИЛОТАМИ ТРИПТОФАН И ТИРОЗИН В СВОБОДНОМ СОСТОЯНИИ ...................................................................................................................... 62
4.1. Выбор экспериментальных условий .................................................................................................. 62
4.2. Распад реагентов при УФ-А-сенсибилизированном фотолизе ......................................................... 64
4.3. Анализ продуктов УФ-А-сенсибилизированного фотолиза ............................................................. 65
4.4. Увеличение константы скорости обратного переноса электрона от KNAH2— к TrpН+ при низких значениях pH ............................................................................................................................................. 68
4.5. Реакция радикала KNAH— с молекулярным кислородом ................................................................. 71
Заключение по материалам главы 4 ......................................................................................................... 72
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ pН НА МЕХАНИЗМЫ И ПРОДУКТЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННЫХ РЕАКЦИЙ МЕЖДУ КИНУРЕНОВОЙ КИСЛОТОЙ И АМИНОКИСЛОТНЫМИ ОСТАТКАМИ ТРИПТОФАНА И ТИРОЗИНА В СОСТАВЕ БЕЛКА ЛИЗОЦИМА......................................................................................... 74
5.1. Влияние рН на реакцию между 3KNAH— и HEWL ........................................................................... 74
5.2. Значение pKa катион-радикала ТrpН в составе HEWL ..................................................................... 77
5.3. Реакции радикалов KNAН— и HEWL ................................................................................................ 78
5.4. Гибель радикалов KNAH— и HEWL при различных значениях pH ................................................. 79
5.5. УФ-А-фотолиз KNAН— и HEWL при разных значениях pH ............................................................ 81
5.6. Ферментативная активность HEWL до и после УФ-А фотолиза при различных значениях pH ..... 82
5.7. Анализ кросс-сшивок HEWL с помощью гель-электрофореза ......................................................... 83
5.8. ВЭЖХ-УФ-МС анализ продуктов фотолиза с низкой молекулярной массой.................................. 84
5.9. ВЭЖХ-УФ-МС анализ HEWL до и после УФ-А фотолиза .............................................................. 86
5.10. Трипсинолиз HEWL после УФ-А фотолиза .................................................................................... 87
5.11. Оксигенирование остатков метионина и триптофана. Потеря молекулы воды оксигенированными формами TrpН ........................................................................................................................................... 88
5.12. Ковалентное присоединение KNAН— к HEWL ............................................................................... 92
5.13. Образование TrpН- и TyrОН-содержащих кросс-сшивок HEWL ................................................... 93
Обсуждение и заключение по материалам главы 5 ................................................................................. 95
ГЛАВА 6. ДИСПРОПОРЦИОНИРОВАНИЕ И ДИМЕРИЗАЦИЯ КИНУРЕНОВОЙ КИСЛОТЫ ПОД ДЕЙСТВИЕМ УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ................................................................................................................. 97
6.1. Предполагаемая схема реакций ......................................................................................................... 97
6.2. Установление механизма УФ-индуцированного диспропорционирования KNAH— ...................... 98
4
6.3. Димеризация KNAН— под действием УФ-А излучения ................................................................. 100
Заключение по материалам главы 6 ....................................................................................................... 102
ГЛАВА 7. МЕХАНИЗМ И ПРОДУКТЫ РЕАКЦИИ МЕЖДУ РАДИКАЛОМ ТРИПТОФАНА И СУПЕРОКСИД-АНИОНОМ ...................................................................................................................... 105
7.1. Схема реакций и выбор условий эксперимента .............................................................................. 105
7.2. Восстановление основных состояний реагентов в радикальных реакциях .................................... 107
7.2.1. Восстановление NTrpH ............................................................................................................. 107
7.2.2. Восстановление KNAН— ........................................................................................................... 109
7.3. Поиск схемы радикальных реакций ................................................................................................ 111
7.4. Распад реагентов при УФ-А-фотолизе ............................................................................................ 117
7.5. Накопление продуктов УФ-А-фотолиза .......................................................................................... 119
7.6. Оценка выходов продуктов фотолиза триптофана на основе кинетической схемы. Сравнение результатов с экспериментальными значениями ................................................................................... 123
Заключение по материалам главы 7 ....................................................................................................... 125
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ................................................................................................ 126
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕАТУРЫ ............................................................................................ 127
ПРИЛОЖЕНИЕ .......................................................................................................................................... 145
