СОДЕРЖДАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
7
ВВЕДЕНИЕ
8
Актуальность темы
8
Степень разработанности
10
Цель исследования
11
Задачи исследований
11
Научная новизна и практическая значимость работы
12
Методология и методы исследования
13
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
14
Степень достоверности и апробация результатов
15
Объем и структура диссертации
18
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
18
Личный вклад
18
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
19
1. Род Allexivirus
19
1.1. Очерк исследований, результаты которых привели к выделению рода Allexivirus
19
1.2. Основные свойства аллексивирусов
21
1.2.1. Вирион
21
3
1.2.2. Капсидный белок и серологические свойства
21
1.2.3. Геном
22
1.2.4. Репликация
23
1.2.5. Спектр хозяев
23
1.2.6. Векторы
24
1.2.7. Заболевания и симптомы
24
1.3. Таксономия и классификация
25
1.4. Географическое распространение
27
2. Х вирус шалота (ХВШ) - прототип рода Allexivirus
28
2.1. Открытие Х вируса шалота
28
2.2. Морфология и серологические свойства вирионов ХВШ
29
2.3. Организация генома Х вируса шалота
31
2.4. Белки, кодируемые геномом Х вируса шалота
35
2.5. Синтез in vitro полноразмерной кДНК-копии геномной РНК ХВШ
39
2.6. Инфекционные РНК-транскрипты полноразмерной кДНК-копии геномной РНК ХВШ в клетках перевиваемой линии клеток сахарной свеклы
41
2.7. Участие ORFan белка p42 в формировании вирионов ХВШ
42
3. Эволюция аллексивирусов
44
3.1. Общие механизмы эволюции фитовирусов с РНК геномом
44
3.2. Концепция вирусного квазивида
50
4
3.3. Эволюционные взаимосвязи в пределах рода Allexivirus
55
4. РНК-интерференция как форма антивирусного фитоиммунитета
61
4.1. Молекулярные механизмы РНК – интерференции как пост–транскрипционого генного сайленсинга
61
4.2. Компоненты механизма посттранскрипционного сайленсинга генов
67
4.2.1. DICER-подобные белки
68
4.2.2. Малые интерферирующие РНК
73
4.2.3. Белки семейства AGO (Argonaute)
77
4.2.4. РНК-зависимая РНК полимераза (RdRP)
80
4.2.5. Эффекторный комплекс
83
5. Вирусные супрессоры РНК-интерференции
86
5.1. Идентификация вирусных супрессоров РНК-интерференции
86
5.2. Механизм действия вирусных супрессоров РНК-интерференции
88
5.3. Комплементационные взаимодействия между различными вирусными супрессорами РНК-интерференции
95
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
98
1. Получение растительного материала
98
2. Оценка уровня накопления Х вируса шалот
98
3. Выделение тотальной РНК
99
4. Получение вирусного препарата ХВШ
99
5
5. Выделение вирусной РНК ХВШ
100
6. Синтез кДНК
100
7. Амплификация индивидуальных фрагментов кДНК
101
8. Амплификация 5’- и 3’ - концевых фрагментов геномной РНК Х вируса шалота
101
9. Фракционирование ампликонов
102
10. ПЦР в реальном времени
103
11 Определение нуклеотидной последовательности
104
12. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
104
13. Клонирование генов
105
14. Анализ полноразмерных кДНК копий генов, кодирующих белки Х вируса шалота
106
15. Инфильтрация векторов
106
16. Инокулирование интактных растений
106
17. Электрофорез в полиакриламидных гелях и иммуноблотинг вирусных белков
107
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
108
1. Анализ изменений в геноме Х-вируса шалота, персистирующего в вегетативно размножаемом шалоте
108
2. Исследование супрессорной активности белков кодируемых 3’-областью генома Х вируса шалота
116
6
3. Подавление экспрессии факторов РНК-сайленсинга при репродукции ХВШ
123
4. Транскрипционное репрограммирование в процессе персистентной инфекции ХВШ
138
5. Репродукция Х вируса шалота в чесноке
155
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
157
ВЫВОДЫ
161
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
163
