ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................... 9
1.1. Протеоформы ........................................................................................................ 9
1.2. Протеом печени человека .................................................................................. 11
1.3. Транскриптом печени человека ......................................................................... 13
1.4. Интеграция транскриптомных и протеомных исследований ........................ 15
1.5. Роль протеоформ при различных заболеваниях .............................................. 18
1.6. Современные методы диагностики ГЦР .......................................................... 19
1.6.1. Биомаркеры ГЦР в клинической практике ................................................ 20
1.6.2. Молекулярно-генетические маркеры на основе геномного секвенирования ....................................................................................................... 22
1.7. Модели клеточных линий гепатоцеллюлярного рака и их сравнение .......... 23
1.8. Методы исследования белков для изучения разнообразия протеоформ ...... 25
1.8.1. Масс-спектрометрические методы ............................................................. 26
1.8.2. Двумерный гель-электрофорез (2DE) ........................................................ 29
1.8.3. Иммуноблоттинг и иммунохимические методы ....................................... 32
1.8.4. Биоинформатический анализ ...................................................................... 33
1.8.4.1. Базы данных протеоформ человека ..................................................... 36
1.9. Заключение литературного обзора ................................................................... 39
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..................................................................................... 41
2.1. Характеристика образцов ................................................................................... 42
2.1.1. Клеточная культура HepG2 ......................................................................... 42
2.1.2 Образцы ткани печени .................................................................................. 42
2.2. Предварительная подготовка образцов ............................................................ 43
2.2.1. Экстракция белков из клеток HepG2 .......................................................... 43
2.2.2. Экстракция белков из ткани печени человека........................................... 43
2.3. Подготовка проб для протеомного профилирования ..................................... 44
2.3.1. Протокол подготовки проб с использованием центрифужных концентраторов ....................................................................................................... 44
2.3.2. Двумерный гель-электрофорез ................................................................... 45
2.4. Гидролитическое расщепление белков ............................................................ 47
2.4.1. Гидролиз с использованием центрифужных концентраторов ................ 47
2.4.2. Гидролиз белков из геля .............................................................................. 48
2.5. Масс-спектрометрический анализ (LC-ESI-MS/MS) ...................................... 48
2.6. Биоинформатический анализ данных ............................................................... 49
2.7. Нормализация данных секционного протеомного профилирования ............ 50
2.8. Анализ и статистическая обработка данных ................................................... 51
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .......................................................................... 52
3.1. Протеомное профилирование белков нормальной ткани печени и белков клеточной линии HepG2 ............................................................................................ 52
3.1.1. Панорамное протеомное профилирование ................................................ 52
3.3.2. Секционное протеомное профилирование ............................................ 55
3.3.3. Комбинирование результатов секционного и панорамного протеомного профилирования .............................................................................. 60
3.4. Протеомное профилирование белков в образцах пациентов с ГЦР .......... 63
3.4.2. Панорамное протеомное профилирование ............................................ 64
3.4.3. Секционное протеомное профилирование ............................................ 69
3.2.3. Комбинирование результатов панорамного и секционного протеомного профилирования ..................................................................................................... 72
3.5. Сравнительный анализ белков клеточной линии HepG2, нормальной ткани печени и образцов ГЦР. .................................................................................. 77
3.5.2. ПТМ потенциальных биомаркеров ГЦР ................................................ 81
3.3.2. Функциональная аннотация потенциальных биомаркеров ГЦР ............. 92
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................. 96
ВЫВОДЫ ....................................................................................................................... 99
ФИНАНСИРОВАНИЕ ................................................................................................ 100
БЛАГОДАРНОСТИ .................................................................................................... 101
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .............................. 102
СПИСОК ТЕРМИНОВ ............................................................................................... 103
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ................................................... 104
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Описание образцов ткани печени ............................................. 118
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Полный список белков идентифицированных двумя методами – секционным и панорамным протеомным профилированием .............................. 119
ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Двумерные электрофореграммы образцов от пациентов с ГЦР ....................................................................................................................................... 120
ПРИЛОЖЕНИЕ 4. Сравнение данных, полученных для 52 белков с наиболее измененными паттернами протеоформ с базой данных Plasma Proteome Database (PPD) ............................................................................................................................. 122
ПРИЛОЖЕНИЕ 5. Тысяча типичных паттернов протеоформ, полученных для всех типов анализированных образцов (клеточная линия HepG2, нормальная ткань печени, опухолевая ткань печени, контрольная ткань печени) .............................. 126
