ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………... 7
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………..…. 28
1.1 Внутривидовое и генетическое разнообразие штаммов Yersinia
pestis................................................................................................................... 29
1.2 Исторические данные по распространению чумы в мире….......... 39
1.3 Актуальность чумы в настоящее время…………………………... 48
1.4 Современные молекулярно-генетические методы диагностики
инфекционных болезней…...…………………..……………………………. 51
Заключение по обзору литературы……………………………………. 94
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………….... 96
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………….……………….. 96
2.1 Материалы……………………………………………….………….. 96
2.1.1 Штаммы микроорганизмов и условия культивирования…….... 96
2.1.2 Реактивы и оборудование………………………………….…...... 108
2.2 Методы…………………………………………………………….... 108
2.2.1 Обеззараживание материала….………………………………...... 108
2.2.2 Изучение биохимических свойств штаммов Y. pestis………...... 109
2.2.3 Определение признака пигментации и зависимости роста от
ионов кальция…….………………………………………………………….. 110
2.2.4 Выделение нуклеиновых кислот………………………………… 111
2.2.5 Проведение ПЦР и ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным
учётом результатов………..……………………………………………….… 111
2.2.6 Фрагментное и полногеномное секвенирование…….………….. 112
2.2.7 Гибридизация в системе мультиплексных ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов на твёрдой
подложке…………………………………………………………………….... 1133
2.2.8 Биоинформационный анализ...…………………………………... 116
2.2.9 Методы статистического анализа…………………………….…. 117
ГЛАВА 3 ИЗУЧЕНИЕ ПОПУЛЯЦИОННОЙ СТРУКТУРЫ
ШТАММОВ КАВКАЗСКОГО, УЛЕГЕЙСКОГО,
ЦЕНТРАЛЬНОАЗИАТСКОГО ПОДВИДОВ YERSINIA PESTIS,
РАСПРОСТРАНЁННЫХ В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ РОССИИ И
СОПРЕДЕЛЬНЫХ СТРАН........................................................................…. 122
3.1 Филогеография штаммов кавказского подвида Y. pestis…............ 122
3.2 Анализ популяционной структуры штаммов улегейского
подвида Y. pestis…….…………………………...……….…………………… 134
3.3 Филогения штаммов центральноазиатского подвида Y. pestis...... 142
3.4 Анализ филогенетической структуры алтайского биовара
центральноазиатского подвида Y. pestis …………….………………...…… 154
Заключение по Главе 3…………………………………………………. 162
ГЛАВА 4 РАЗРАБОТКА СПОСОБА ДЕТЕКЦИИ И
ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ
ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ (ОТДЕЛЬНО
АЛТАЙСКОГО БИОВАРА ЦЕНТРАЛЬНОАЗИАТСКОГО ПОДВИДА)
МЕТОДОМ ПЦР-РВ……………………………………………………….... 165
4.1 Подбор ДНК-мишеней, праймеров, зондов и оптимальной
программы амплификации ПЦР-РВ………………………………………... 166
4.2 Сравнительный анализ эффективности разработанного способа
и набора реагентов «ГенПест-индикация-РГФ»…………..………………. 168
4.3 Проведение клинических испытаний «ГенПест-подвид/алтайРГФ» с определением диагностической чувствительности и
специфичности……………………………………………………………….. 172
Заключение по Главе 4…………………………………………………. 1744
ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННЫХ
ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РАСПРОСТРАНЕНИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ
ОСОБЕННОСТЕЙ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS ЛИНИИ
ЭВОЛЮЦИИ 1.ORI………………..………………………………………… 176
5.1 Изучение биохимических свойств и плазмидного профиля
штаммов из природных очагов Вьетнама…………………...……………... 178
5.2 Филогенетический анализ штаммов Y. pestis, выделенных в
Социалистической Республике Вьетнам……………...……………………. 179
5.3 Определение внутривидовой принадлежности штамма Y. pestis
из Илийского межгорного очага………………..…………………………... 190
Заключение по Главе 5…………………………………………………. 194
ГЛАВА 6 СОЗДАНИЕ СПОСОБА ИНДИКАЦИИ И
ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ПО ИХ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ К
ВИДУ YERSINIA PESTIS, ПОДВИДАМ, БИОВАРАМ, ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИМ ВЕТВЯМ, А ТАКЖЕ ПО НАЛИЧИЮ ОСНОВНЫХ ГЕНОВ
ПАТОГЕННОСТИ С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ
ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЁТОМ
РЕЗУЛЬТАТОВ НА ТВЁРДОЙ ПОДЛОЖКЕ…………………………….. 195
6.1 Подбор ДНК-мишеней, расчёт праймеров и зондов для
индикации и идентификации штаммов по их принадлежности к виду
Y. pestis, подвидам, биоварам, филогенетическим ветвям, а также по наличию основных генов факторов патогенности………………………… 196
6.2 Структура и схема интерпретации результатов разработанного
способа индикации и идентификации штаммов по их принадлежности к
виду Y. pestis, подвидам, биоварам, филогенетическим ветвям, а также
по наличию основных генов факторов патогенности……………………... 200
6.3 Конструирование набора реагентов для выявления и
внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis методом
мультилокусной ПЦР в формате биочипа «Пест-МЛ ПЦР-биочип»…...... 2085
Заключение по Главе 6…………………………………………………. 213
ГЛАВА 7 РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВНУТРИВИДОВОЙ
ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ОСНОВНЫХ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЕТВЕЙ
YERSINIA PESTIS МЕТОДОМ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЦР-РВ... 215
7.1 Поиск ДНК мишеней и конструирование праймеров для
проведения внутривидовой дифференциации основных
филогенетических ветвей Y. pestis.................................................................. 215
7.2 Подбор условий амплификации и оценка специфичности
разработанного комплекса аллель-специфических ПЦР-РВ……………... 217
Заключение по Главе 7…………………………………………………. 224
ГЛАВА 8 СОЗДАНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ СИСТЕМЫ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ
ШТАММОВ YERSINIA PESTIS……………………...……..…...…………... 226
Заключение по Главе 8…………………………………………………. 235
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………….………………………... 236
ВЫВОДЫ…………..……………………………….………………..…. 252
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ…..…. 255
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ……………………………………………...… 259
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……………….….... 261
Приложение А. Номера доступа депонированных в базе данных
NCBI GenBank геномов Y. pestis……………...………………………...…… 343
Приложение Б. Регистрационное удостоверение на медицинское
изделие для in vitro диагностики «Набор реагентов для выявления и
дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных
подвидов (отдельно алтайского биовара центральноазиатского подвида)
методом полимеразной цепной реакции с гибридизационнофлуоресцентным учётом результатов в режиме реального времени
(ГенПест-подвид/алтай-РГФ)»..…..……………………………..……….….. 3446
Приложение В. Акт внедрения МИ «ГенПест-подвид/алтай-РГФ» от
ФКУЗ Иркутский НИПЧИ Роспотребнадзора…………………..………..… 346
Приложение Г. Акт внедрения МИ «ГенПест-подвид/алтай-РГФ» от
ФКУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора…………………....…….. 349
Приложение Д. Акт использования изобретения «Способ
индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы по их
принадлежности к виду Y. pestis, к подвидам, биоварам,
филогенетическим ветвям и по наличию генов основных факторов
патогенности методом ДНК-чипа» от ФКУН Российский
противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора…………………... 350
Приложение Е. Регистрационное удостоверение на медицинское
изделие для in vitro диагностики «Набор реагентов для выявления и
внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба методом
мультилокусной ПЦР в формате биочипа (Пест-МЛ ПЦРбиочип)»……………………………………………..………………....……… 351
Приложение Ж. Акт внедрения МИ «Пест-МЛ ПЦР-биочип» от
ФКУЗ Волгоградский НИПЧИ Роспотребнадзора…………………….….... 353
Приложение З. Акт внедрения МИ «Пест-МЛ ПЦР-биочип» от
ФКУЗ Ставропольский НИПЧИ Роспотребнадзора……………….………. 354
