ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................. 5
Актуальность и степень разработанности темы исследования ..................................................... 5
Цель и задачи исследования.............................................................................................................. 6
Научная новизна исследования ........................................................................................................ 7
Теоретическая и практическая значимость ..................................................................................... 8
Методология и методы исследования .............................................................................................. 9
Основные положения диссертации, выносимые на защиту .......................................................... 9
Степень достоверности и апробация результатов ........................................................................ 10
Публикации....................................................................................................................................... 11
Персональный вклад автора ............................................................................................................ 13
Структура и объем диссертационной работы ............................................................................... 14
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................... 15
1.1. Общая характеристика микобактерий туберкулезного комплекса ...................................... 15
1.2. Генетические особенности представителей комплекса ........................................................ 17
1.3. Методы типирования MTBC.................................................................................................... 19
1.3.1. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов IS6110............................ 20
1.3.2. Сполиготипирование ......................................................................................................... 22
1.3.3. MIRU-VNTR типирование ................................................................................................ 24
1.3.4. Анализ протяженных делеций .......................................................................................... 25
1.3.5. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов ................................................................... 26
1.4. Эволюция MTBC....................................................................................................................... 28
1.5. Филогенетическая структура MTBC....................................................................................... 31
1.5.1. Структура MTBC, адаптированных к животным............................................................ 32
1.5.2. Популяционная структура MTBC, адаптированных к человеку................................... 34
1.6. Биологические последствия разнообразия MTBC................................................................. 37
1.6.1. Изменения на уровне экспрессии генов и синтеза белков ............................................. 38
1.6.2. Различия в бактериальном росте ...................................................................................... 38
3
1.6.3. Иммунологические последствия разнообразия MTBC .................................................. 39
1.7. Разнообразие штаммов и эволюция лекарственной устойчивости ...................................... 40
1.8. Кандидаты в противотуберкулезные препараты как перспектива контроля заболевания 42
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................ 46
2.1. Бактериальные штаммы и образцы ДНК................................................................................ 46
2.2. Оценка антимикробного действия потенциальных противотуберкулезных препаратов .. 46
2.3. Геномные последовательности ................................................................................................ 48
2.4. Амплификация и секвенирование фрагментов генома M. tuberculosis ............................... 49
2.5. Полногеномное секвенирование.............................................................................................. 50
2.6. Транскриптомные исследования ............................................................................................. 51
2.6.1. Выделение РНК.................................................................................................................. 51
2.6.2. РНК-секвенирование.......................................................................................................... 52
2.7. Биоинформатическая обработка данных ................................................................................ 52
3. РЕЗУЛЬТАТЫ .................................................................................................................................. 57
3.1. Коллекция геномных последовательностей охарактеризованных образцов MTBC.......... 57
3.2. Унифицированная классификация MTBC на основе однонуклеотидных полиморфизмов
............................................................................................................................................................ 61
3.3. Наиболее полная карта регионов отличий MTBC ................................................................. 65
3.4. Генетические особенности M. tuberculosis линии 2............................................................... 74
3.4.1. Номенклатура M. tuberculosis линии 2 на уровне однонуклеотидных полиморфизмов
........................................................................................................................................................ 74
3.4.2. Особенности M. tuberculosis линии 2 на уровне RD....................................................... 81
3.4.3. Геномные особенности M. tuberculosis линии 2 на уровне IS6110 ............................... 84
3.5. M. tuberculosis L2.2.M4.5 (Beijing B0/W148) как пример “успешной” популяции............. 90
3.5.1. Эволюция лекарственной устойчивости M. tuberculosis L2.2.M4.5.............................. 95
3.6. Лиганды к G-квадруплексам как потенциальные противотуберкулезные препараты....... 96
3.6.1. Поиск вероятных G4-формирующих последовательностей .......................................... 96
3.6.2. Исследование антимикробной активности лигандов к G4 ............................................ 97
4
3.6.3. Влияние лигандов на экспрессию генов, связанных с G4s............................................ 99
3.6.4. Изменения в экспрессии систем репликации и репарации ДНК, опосредованные
лигандами G4.............................................................................................................................. 101
3.6.5. Функциональный анализ дифференциально экспрессирующихся генов ................... 103
4. ОБСУЖДЕНИЕ .............................................................................................................................. 106
4.1. Специфические SNPs как удобные маркеры популяции .................................................... 108
4.2. RDs - вытесненный маркер эволюции .................................................................................. 111
4.3. Генетическое разнообразие M. tuberculosis линии 2: от эпидемиологии к биологии ...... 112
4.3.1. SNPs для фундаментальной и прикладной науки ......................................................... 114
4.3.2. Роль IS6110 и RDs в эволюции M. tuberculosis линии 2............................................... 117
4.4. G4 как потенциальные антимикробные мишени ................................................................. 119
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 121
ВЫВОДЫ............................................................................................................................................ 123
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ........................................................................ 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................. 125
ПРИЛОЖЕНИЯ.................................................................................................................................. 143
Приложение 1. Наиболее значимые публикации для составления выборки образцов ........... 143
Приложение 2. Распределение образцов по странам.................................................................. 145
Приложение 3. Коллекция 670 образцов, включающая все разнообразие MTBC .................. 147
Приложение 4. Филогенетические деревья отдельных линий MTBC...................................... 162
Приложение 5. SNP-баркоды для дифференциации MTBC ...................................................... 166
Приложение 6. Образцы для анализа регионов отличия............................................................ 172
Приложение 7. Наиболее полный список регионов отличия .................................................... 187
