Введение 7
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1 Ферменты метаболизма ди- и трикарбоновых кислот 14
1.1.1 Строение сукцинатдегидрогеназы 14
1.1.1.1 Молекулярные аспекты функционирования сукцинатдегидрогеназы 20
1.1.2 Структура и регуляция цитратсинтазы 24
1.1.2.1 Формы цитратсинтазы и их функциональная роль 31
1.1.2.2 Молекулярная биология цитратсинтазы 35
1.1.3 Общая характеристика аконитазной системы 38
1.1.3.1 Регуляция аконитатгидратазы 44
1.1.3.2 Генетическая детерминация аконитазы 46
1.2 Роль фоторецепторов с световой регуляции метаболизма растений 48
1.2.1 Общая характеристика фитохромов 48
1.2.2 Внутриядерные транскрипционные факторы 52
1.2.3 Роль катионов кальция в реализации фитохромного сигнала в
растительной клетке
54
1.2.4 Структура и функциональная роль кальмодулина 58
1.3 Эпигенетические механизмы регуляции функционирования ферментов 71
1.3.1 Роль метилирования в организации генома 71
1.3.2 Метилирование остатков аденина в ДНК растений 74
1.3.3 Ферменты, осуществляющие метилирование ДНК 77
1.3.4 Метилирование промоторов, как механизм регуляции экспрессии генов 78
3
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 79
2.1 Объект исследования 79
2.2 Методы исследования 79
2.2.1 Создание разных условий светового режима 79
2.2.2 Определение активности сукцинатдегидрогеназы 80
2.2.3 Определение активности цитратсинтазы 80
2.2.4 Определение активности аконитатгидратазы 80
2.2.5. Определение количества белка 81
2.2.6 Выделение ядер 81
2.2.7 Определение концентрации катионов Са2+ 81
2.2.8 Определение перекрестного загрязнения фракций 82
2.2.9 Электрофоретическое исследование сукцинатдегидрогеназы 82
2.2.10 Очистка сукцинатдегидрогеназы 82
2.2.11 Очистка цитратсинтазы 83
2.2.12 Очистка аконитазы 84
2.2.13 Исследование регуляторных свойств ферментов 84
2.2.14 Выделение РНК 85
2.2.15 Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот 85
2.2.16 Обратная транскрипция 85
2.2.17 Полимеразная цепная реакция в реальном времени 87
2.2.18 Выделение ДНК и обработка бисульфитом 88
2.2.19 Анализ промоторов генов исследуемых изоферментов и подбор
праймеров для метилспецифичной ПЦР
88
4
2.2.20 Метилспецифическая полимеразная цепная реакция 88
2.2.21 Расчет степени метилирования промоторов генов исследуемых
изоферментов
89
2.2.22 Статистическая обработка данных 89
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 90
3.1 Очистка изоферментов сукцинатдегидрогеназы, аконитатгидратазы и
цитратсинтазы из кукурузы
90
3.1.1 Очистка изоферментов сукцинатдегидрогеназы из листьев кукурузы 90
3.1.2 Определение физико-химических характеристик сукцинатдегидрогеназы 94
3.1.3 Определение величины константы Михаэлиса для изоферментов
сукцинатдегидрогеназы
95
3.1.4 Определение рН-оптимума для изоферментов сукцинатдегидрогеназы 96
3.1.5 Влияние малоната на активность изоферментов сукцинатдегидрогеназы 98
3.2 Очистка аконитатгидратазы из кукурузы 100
3.2.1 Исследование гомогенности и специфической активности
аконитатгидратазы из кукурузы
102
3.2.2 Регуляция активности аконитатгидратазы органическими кислотами 102
3.3 Очистка цитратсинтазы из кукурузы 103
3.4 Световая регуляция экспрессии генов исследуемых изоферментов 106
3.4.1 Экспрессия генов сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы в
условиях различного светового режима
108
3.4.2 Исследование экспрессии генов сукцинатдегидрогеназы в листьях
Arabidopsis thaliana дикого типа и дефицитных по генам фитохрома А и В
111
3.4.3 Экспрессия генов аконитазы в листьях кукурузы в условиях различного 117
5
светового режима
3.4.4 Экспрессия генов цитратсинтазы в листьях кукурузы в условиях
различного светового режима
119
3.5 Трансдукция светового сигнала 122
3.5.1 Роль катионов кальция в трансдукции фоторецепторного сигнала к
клетке
122
3.5.2 Экспрессия факторов PIF в условиях разного светового режима 128
3.5.3 Роль кальмодулинов в трансдукции фоторецепторного сигнала в клетках
кукурузы
142
3.6 Эпигенетические механизмы регуляции генов исследуемых изоферментов 150
3.6.1 Анализ промоторов генов сукцинатдегидрогеназы, цитратсинтазы и
аконитатгидратазы
150
3.6.2 Анализ степени метилирования промоторов генов исследуемых
изоферментов в различных световых режимах
163
Заключение 172
Список литературы 180
