Оглавление
Введение ..................................................................................................................................5
Глава 1. Обзор литературы ..................................................................................................13
1.1 Биоплёнки ................................................................................................................... 13
1.2 P. aeruginosa ............................................................................................................... 16
1.3 Биоплёнки P. aeruginosa ............................................................................................ 17
1.4 S. aureus ....................................................................................................................... 20
1.5 Биоплёнки S. aureus ................................................................................................... 21
1.6 Устойчивость биоплёнок к антибиотикам .............................................................. 22
1.7 Стратегии борьбы с биоплёнками ............................................................................ 24
1.8 Лектин LecA P. aeruginosa ........................................................................................ 35
1.9 Функции LecA ............................................................................................................ 38
1.10 Блокаторы LecA ....................................................................................................... 40
1.11 Полисахариды и олигосахариды – ингибиторы образования биоплёнок .......... 48
1.12 Антибактериальные лизины ................................................................................... 58
1.13 Ферменты, разрушающие матрикс биоплёнок ..................................................... 64
Глава 2. Материалы и методы .............................................................................................67
2.1 Штаммы и реактивы .................................................................................................. 67
2.2 Клонирование, наработка и выделение рекомбинантного LecA .......................... 68
2.3 Гемагглютинация ....................................................................................................... 70
2.4 Изотермальная титрационная калориметрия (ITC) ................................................ 71
2.5 Культивирование, ингибирование и разрушение биоплёнок P. aeruginosa в 96-
луночных планшетах ....................................................................................................... 72
2.6 Культивирование, ингибирование и разрушение биоплёнок P. aeruginosa на
полипропиленовых купонах ........................................................................................... 74
2.7 Определение влияния полисахаридов на планктонный рост P. aeruginosa ......... 75
2.8 Определение МИК и МБК ........................................................................................ 76
2.9 Определение МКЭБ ................................................................................................... 77
2.10 Определение количества жизнеспособных бактерий в биоплёнках P. aeruginosa
............................................................................................................................................ 79
2.11 Флуоресцентная микроскопия ................................................................................ 80
3
2.12 Клонирование, наработка и очистка лизостафина, дисперсина, Lst-DspB ........ 81
2.13 Определение пептидазной активности лизостафина и Lst-DspB ........................ 83
2.14 Определение гликозидгидролазной активности дисперсина и Lst-DspB .......... 84
2.15 Определение бактериолитической активности лизостафина и Lst-DspB .......... 84
2.16 Определение МИК лизостафина, Lst-DspB и диопсида ....................................... 85
2.17 Культивация и разрушение биоплёнок S. aureus .................................................. 85
2.18 Адсорбция белков на диопсид ................................................................................ 87
2.19 Кинетика выхода белков с диопсида ..................................................................... 87
2.20 Иммуноферментный анализ .................................................................................... 88
2.21 Оценка антибактериальной активности лизостафина по зонам лизиса ............. 88
2.22 Статистический анализ ............................................................................................ 89
Глава 3. Результаты ..............................................................................................................90
3.1 Клонирование, наработка и выделение LecA ......................................................... 90
3.2 Тестирование олигосахаридов на способность связываться с LecA .................... 92
3.3 Тестирование олигосахаридов на способность подавлять образование биоплёнок P. aeruginosa ..................................................................................................................... 99
3.4 Тестирование полисахаридов на способность связываться с LecA .................... 100
3.5 Тестирование полисахаридов на способность подавлять образование биоплёнок P. aeruginosa ................................................................................................................... 101
3.6 Детальное исследование влияния галактана на биоплёнки P. aeruginosa ......... 102
3.7 Влияние галактана на планктонный рост P. aeruginosa....................................... 112
3.8 Тестирование совместного действия антибиотиков и галактана на биоплёнки P. aeruginosa ........................................................................................................................ 116
3.9 Возобновление роста биоплёнки, обработанной амикацином, с помощью фосфатов, физического разрушения или галактана ................................................... 123
3.10 Действие галактана на биоплёнки других видов ................................................ 124
3.11 Клонирование, наработка и выделение лизостафина, дисперсина и химерного белка Lst-DspB ................................................................................................................ 126
3.12 Пептидазная активность лизостафина и Lst-DspB ............................................. 126
3.13 Гликозидгидролазная активность дисперсина и Lst-DspB ................................ 127
3.14 Бактериолитическая активность лизостафина и Lst-DspB ................................ 128
3.15 Действие лизостафина, дисперсина, их смеси и Lst-DspB на биоплёнки S. aureus ............................................................................................................................... 130
4
3.16 Адсорбция и высвобождение лизостафина и дисперсина из диопсида ........... 136
3.17 Антибактериальная и антибиоплёночная активность диопсида с лизостафином .......................................................................................................................................... 139
Глава 4. Обсуждение результатов .................................................................................... 141
Заключение ......................................................................................................................... 155
Выводы ............................................................................................................................... 158
Список сокращений и условных обозначений ............................................................... 159
Список литературы ............................................................................................................ 160
