ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений…………………………………………………………………………….7
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………………...11
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………31
1.1. Редокс-регуляция живых систем……………………………………………………….31
1.1.1. Краткая история редокс-биологии, общие принципы………………………………...31
1.1.2. Активные формы кислорода (АФК)……………………………………………………39
1.1.3. Активные формы галогенов (АФГ)…………………………………………………….61
1.1.4. Активные формы азота (АФА)………………………………………………………….68
1.1.5. Активные формы серы (АФС)…………………………………………………………..73
1.2. Флуоресцентные генетически кодируемые биосенсоры…………………………...85
1.2.1. Определение термина биосенсор……………………………………………………….85
1.2.2. Флуоресцентные белки и биосенсоры на их основе…………………………………..88
1.2.2.1 Флуоресцентные белки – биосенсоры активности промоторов………………….94
1.2.2.2 Флуоресцентные белки и их модифицированные версии, чувствительные к
определенным параметрам………………………..…………………………………………………….96
1.2.2.3 Биосенсоры, состоящие из сенсорного домена и флуоресцентного белка…….98
1.2.2.4 Биосенсоры на основе двух флуоресцентных белков………………………………101
1.2.3. Редокс-биосенсоры на основе флуоресцентных белков……………………………105
1.2.3.1 Биосенсоры для регистрации О2……………………………………………..………..105
1.2.3.2 cpYFP – сенсор для регистрации О2
•¯?................................................................106
1.2.3.3 Биосенсоры для регистрации Н2О2……………………………………………………108
1.2.3.4 Биосенсоры для регистрации органических гидропероксидов ROOH………….113
1.2.3.5 Биосенсоры для регистрации •NO……………………………………………………..115
1.2.3.6 Биосенсоры для регистрации ONOO¯………………………………………………….117
1.2.3.7 Биосенсоры для регистрации гипогалогенных кислот………………………………118
1.2.3.8 Биосенсоры для регистрации метионинсульфоксида……………………………….118
1.2.3.9 Биосенсоры для регистрации H2S……………………………………………………….120
1.2.3.10 Биосенсоры для регистрации редокс-статуса низкомолекулярных тиол-
содержащих соединений………..……………………………………………………………………....121
1.2.3.11 Биосенсоры для регистрации полисульфидов………………………………………..127
1.2.3.12 Биосенсоры для регистрации редокс-статуса Trx…………………………………128
3
1.2.3.13 Биосенсоры для регистрации NAD(H)….……………………………………………...130 1.2.3.14 Биосенсоры для регистрации NADP(H)……………………………………………….134 1.2.3.15 Мировая коллекция редокс-биосенсоров. Заключение…………………………..….138 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………………………149 2.1. Общие методы в работе с генетически кодируемыми биосенсорами……………149 2.1.1. Манипуляции с генетическими конструкциями…………………………..………….149 2.1.1.1. Амплификация ДНК…………………………………………………………………………149 2.1.1.2. ПЦР скрининг……..……………………………………………………………..…………..150 2.1.1.3. Электрофорез ДНК фрагментов в агарозном геле……..………………………….150 2.1.1.4. Рестрикция ДНК……..……………………………………………………………..……….150 2.1.1.5. Лигирование ДНК……………………………………………………………………………150 2.1.1.6. Определение концентрации ДНК…………….…………………………………………..150 2.1.1.7. Трансформация бактериальных клеток………….…………………………………….151 2.1.1.8. Культивирование бактериальных клеток………..…………………………………..151 2.1.1.9. Выделение и анализ плазмидной ДНК……………..…………………………………….151 2.1.2. Скрининг бактериальных клонов по флуоресцентному сигналу………………….152 2.1.3. Получение белкового препарата биосенсора……………………………………….152 2.1.4. Определение спектральных характеристик биосенсора…………………………….154 2.1.5. Определение зависимости сигнала биосенсора от рН………………………………155 2.1.6. Определение чувствительности биосенсора………………………………………….156 2.1.7. Определение селективности биосенсора……………………………………………...156 2.1.8. Используемые в работе вирусы………………………………………………………..157 2.1.9. Используемые в работе клеточные культуры эукариот……………………………..158 2.1.9.1.
HeLa Kyoto (EMBL), HEK293 (ATCC)…………………………………………………..158 2.1.9.2. Смешанная нейрональная культура, выделенная из мозга мышиных эмбрионов………………………………………………………………………………………………….158 2.1.9.3. Культура неонатальных кардиомиоцитов крысы………………………………….159 2.1.9.4. Культура зрелых кардиомиоцитов крысы…………………………………………….160 2.1.9.5. Культура человеческих полиморфноядерных лейкоцитов……………………….160 2.1.10. Используемые в работе животные………..………………………………………….161 2.1.10.1. Рыбы Danio rerio…………………..………………………………………………………161 2.1.10.2. Мыши C57Bl/6………………………………………………………………………………162 2.1.10.3. Крысы SHR………………………………………………………………………………….162
4
2.2. Разработка красной версии редокс-чувствительного флуоресцентного белка
roRFP……………………………………………………………………………………….…..162 2.2.1. Получение молекулярно-генетических конструкций roRFP…….………………….162 2.2.2. Определение редокс-потенциала флуоресцентных редокс-чувствительных белков………………………………………..……………………………………………….....163 2.2.3. Микроскопия Grx1-roCherry в клеточных культурах………………………………..164 2.2.4. Проточная цитометрия………………….………………………………………………164 2.3. Разработка биосенсора для регистрации гипогалогенных кислот………………165 2.3.1. Получение молекулярно-генетических конструкций версий Hypocrates…………..165 2.3.2. Определение кинетических свойств NemRC106 и Hypocrates……………………….166 2.3.3. Определение пространственной структуры Hypocrates……………………………167 2.3.4. Измерение активности миелопероксидазы с помощью Hypocrates…………………167 2.3.5. Микроскопия Hypocrates в клеточных культурах………………………………….169 2.4. Моделирование условий гипоксии/реоксигенации в культуре клеток и тканях рыб Danio rerio…………………………………………………………..…………………………..170 2.4.1. Особенности работы с гиппокампальной нейрональной культурой, полученной из эмбрионов мыши, в модели гипоксии……………………………………………………….171 2.4.2. Особенности работы с культурой кардиомиоцитов, полученной из эмбрионов или взрослых крыс, в модели гипоксии…………………..………………………………………..172 2.4.3. Рамановская микроспектрометрия для определения редокс-статуса митохондрий зрелых и неонатальных кардиомиоцитов……………….…………………………………….172 2.4.4. Особенности работы с эмбрионами рыб Danio rerio в модели гипоксии…………173 2.4.5. Определение внутриклеточного рН в тканях рыб Danio rerio……………………173 2.5. Исследование динамики биохимических параметров в клетках головного мозга крыс in vivo при ишемическом инсульте с помощью биосенсоров и оптоволоконного интерфейса…………………………………………………………………………………….174 2.5.1. Инъекция вирусных частиц в ткани мозга крыс и имплантация оптических волокон……………………………………………………………………………………...…..174 2.5.2. Модель ишемического инсульта мозга у крыс путем окклюзии средней мозговой артерии………………………………………………………………………………………….175 2.5.3. Модель стрептозотоцин-индуцируемого сахарного диабета у крыс………………..177 2.5.4. Определение рН в клетках мозга крыс in vivo………………………………………177 2.5.5. Проверка функционирования биосенсора HyPer7 в тканях мозга ex vivo………...178
5
2.6. Исследование динамики редокс-параметров в тканях Danio rerio in vivo в условиях воспаления…………………………………………………..……………………..…………..178 2.7. Тестирование биосенсоров в мультифотонном режиме возбуждения флуоресценции……………………………………………………………………………..….179 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ……………………………………………181 3.1. Новые редокс-биосенсоры……………………………………………………………181 3.1.1. Редокс-чувствительные белки с красной эмиссией флуоресценции…………………181 3.1.1.1. Создание и скрининг версий красных редокс-чувствительных белков…………….183 3.1.1.2. Свойства Grx1-roCherry………………………………………………………………..189 3.1.1.3. Прямое сравнение Grx1-roCherry и Grx1-roGFP2 в одной системе экспрессии………………………………………………………………………………………………....193 3.1.1.4. Редокс-статус цитозоля и митохондриального матрикса клетки при воздействии диметилфумарата………………………………………………………………..…………………......194 3.1.1.5. Изменение редокс-статуса разных типов клеток при смещении метаболизма от гликолиза к окислительному фосфорилированию………….……………………………………..196 3.1.1.6. Редокс-различия в компартментах разных типов клеток при локализованной продукции Н2О2………………..………………………………………………………………………….198 3.1.2. Биосенсор для регистрации гипогалогенных кислот…………………………….201 3.1.2.1. Создание и скрининг версий биосенсора для регистрации гипогалогенных кислот……………………………………………………………………………………………………....203 3.1.2.2. Свойства биосенсора Hypocrates……………………..………………………………....206 3.1.2.3. Создание контрольной версии для биосенсора Hypocrates………….……………215 3.1.2.4. Пространственная структура HypocratesCS………………………………………217 3.1.2.5. Биосенсор Hypocrates в клетках эукариот……………………………………………..219 3.2. Исследования редокс-процессов в моделях
in vivo с помощью генетически кодируемых биосенсоров………………………..…………………………..……………….223 3.2.1. Разработка систем для исследования динамики биохимических параметров в условиях гипоксии/ишемии………………………………………………………………………………225 3.2.1.1. Разработка установки для моделирования условий гипоксии/реоксигенации в культурах клеток и тканях рыб Danio rerio……………………………………………………….225 3.2.1.2. Разработка платформы для исследований биохимических процессов в тканях мозга лабораторных грызунов с помощью оптоволоконного интерфейса и биосенсоров………………………………………………………………………………………………..228
6
3.2.2. Динамика ацидоза в культуре нейронов при гипоксии и в тканях мозга крыс при ишемическом инсульте……………………………………….………………………………..233 3.2.3. Динамика Н2О2 в культуре нейронов при гипоксии и в тканях мозга крыс при ишемическом инсульте…………………………..…………………………………………….237 3.2.4. Гипергликемия усугубляет последствия инсульта не через генерацию Н2О2……...245 3.2.5. Биосенсоры на основе
cpYFP в мультифотонном режиме возбуждения флуоресценции……………………………………………………………………………….....251 3.2.6. Редокс-параметры в кардиомиоцитах при гипоксии/реоксигенации……………...256 3.2.7. Рыба Danio rerio в модели гипоксии/реоксигенации………………………………...262 3.2.8. In vivo регистрация динамики гипогалогенных кислот и Н2О2 при воспалении в тканях на модели рыбы Danio rerio……………………………………………………………….….269 ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………….273 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………………………293 Список цитируемой литературы……………………………………………………………..295 Благодарности……………………………………………………………………………...…...352
