ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….………………………….5
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ………………………………………………..……………………….………..15
Глава 1. Обзор литературы………………………………………………………………………..….15
1.1. Общая характеристика и разнообразие ферментов, расщепляющих нуклеиновые
кислоты………………………………………………………………………………………………...15
1.1.1 Реакции, катализируемые нуклеазами…………………….…………………….…….…..16
1.1.2 Экзо- и эндонуклеазы……………………………………………………………….……...20
1.1.3 Субстратная специфичность нуклеаз……………………………………….…….……….21
1.1.4 Механизмы катализа……………………………………………………………………….29
1.1.5 Нуклеазы, катализирующие расщепление субстрата с участием двух или более ионов
металла…………………………………………………………………………………………...…… 32
1.1.5.1 DEDD-мотив содержащие (или ДнкQ-подобные) нуклеазы ………………...…… 36
1.1.5.2 LAGLIDADG-содержащие хоуминг-эндонуклеазы…………………….…….…….42
1.1.5.3 Суперсемейство PD-(D/E)XK………………………………………….……….…….45
1.1.5.4 FEN-подобные нуклеазы……………………………………………….…….……….46
1.1.6 Нуклеазы, катализирующие расщепление субстрата с участием одного иона
металла………………………………………………………………………………………......……. 47
1.1.6.1 Нуклеазы His-Me…………………………………………………….……….………..48
1.1.6.2 HUH эндонуклеазы (релаксазы)…………………………………………...…………53
1.1.6.3 Хоуминг-эндонуклеазы, содержащие His-Cys мотив………………………….……55
1.1.6.4 ДНКаза I подобные нуклеазы…………………………………………..……….…….55
1.1.6.5 GIY-YIG эндонуклеазы………………………………………………...……………..56
1.1.7 Суперсемейство TOPRIM — нуклеазы, катализирующие расщепление нуклеиновых
кислот с участием одного или двух ионов металла………………………………………………….57
1.1.8 Нуклеазы, осуществляющие катализ, не зависимый от ионов металла………..………..60
1.1.8.1 Нуклеазы суперсемейства фосфолипазы D……………………………….…………61
1.1.8.2 РНКазы-колицины…………………………………………………………...………..62
1.1.8.3 Суперсемейство РНКазы А……………………………………………….……..……63
1.1.8.4 Топоизомеразы IB……………………………………………………….…………….63
1.1.8.5 Сиквенс-специфические рекомбиназы……………………………….…….………..64
1.1.8.6 Другие металлонезависимые нуклеазы………………………………...…………….66
1.1.9 Каталитические механизмы рибозимов и дезоксирибозимов………….………………..67
3
1.2. Использование нуклеаз в биотехнологии и медицине……………………………….……….70
1.3. Некоторые методы анализа нуклеиновых кислот, требующие выделения одноцепочечной
ДНК…………………………………………………………………………………………………….78
1.3.1 Нормализация кДНК и геномной ДНК………………………………………....…………78
1.3.2 Удаление нецелевых транскриптов из библиотек кДНК…………………..……….…….94
1.3.3 Анализ генетических полиморфизмов и выявление целевых последовательностей НК в
биологических образцах……………………………………………………………………..……….97
1.3.3.1 Технологии на основе кинетики гибридизации НК…………………………...…….99
1.3.3.2 Технологии на основе реакции удлинения праймера……………………….…..….102
1.3.3.3 Методы, основанные на использовании нуклеазной активности……………....…106
1.3.3.4 Технологии на основе лигирования………………………………….….………..…108
1.3.3.5 Методы на основе анализа конформационных изменений………….…………….109
Глава 2. Материалы и методы……………………………………………………… ………………112
2.1. Олигонуклеотиды…………………………………………………………….………..………112
2.2. Выделение и очистка НК…………………………………………………….………….…….112
2.3. Секвенирование ДНК………………………………………………………… ………..……..113
2.4. Синтез первой цепи кДНК…………………………………………………… …………..…..113
2.5. Амплификация и клонирование ДНК……..………………………………… ………….…...114
2.6. ПЦР в реальном времени…………………………………………………… …...…………...124
2.7. Сайт-направленный мутагенез…………………………………………….…………..……...125
2.8. Рестрикционный анализ…………………………………………………….……………..…..126
2.9. Гибридизация НК с радиоактивно мечеными пробами……...……………..…………..…...127
2.10. Получение рекомбинантных белков……...…………………………………………..…......127
2.11. Получение поликлональных антител………………………………...………………..……128
2.12. Приготовление ацетонового порошка из гепатопанкреаса камчатского краба…….……..128
2.13. Выделение Par_DSN из камчатского краба…………………………………...………….…128
2.14. Определение активности Par_DSN…………………………………………….……………129
2.15. Исследование параметров, влияющих на активность Par_DSN………….……..……..…..130
2.16. Определение субстратной специфичности………………………………...……………….131
2.17. Масс-спектрометрический анализ……………………………..……………………………133
2.18. Анализ последовательностей НК и аминокислот……….……………...…………………..134
2.19. ДСНП-анализ…………………………………………………………………………………135
2.20. Статистическая обработка данных……………………………………………………….…137
2.21. Выявление целевых молекул РНК……………………….………………………………….139
4
2.22. ДСН-детекция…………………………………………………………….…………………..140
2.23. Аллель-специфическая ПЦР, совмещенная с ДСН-детекцией……………...………….….142
2.24. ДСН-нормализация кДНК………...…………………………………………………………142
2.25. ДСН-нормализация геномной ДНК...……………….……………………………………....144
2.26. ДСН-деплеция……...…………………………………………………………………….….. 145
2.27. Вычитающая гибридизация…………………………………………………………….……147
Глава 3. Результаты и обсуждение……………………………………………….…………...…….148
3.1. Идентификация термостабильной нуклеазы, селективно расщепляющей двухцепочную
ДНК, и её характеристика……………………………………………………………….…….…….148
3.2. Идентификация семейства нуклеаз, специфически расщепляющих дц ДНК, и его
структурно-функциональная характеристика……………………………………………………..169
3.3. Методы анализа мутаций и выявления ДНК-мишеней в сложных смесях нуклеиновых
кислот………………………………………………………………………………….…………..…195
3.4. Нормализация кДНК …………………………………………………………….…………...223
3.5. Нормализация геномной ДНК ………………………………………………………….…....242
3.6. Селективное удаление нецелевых последовательностей из образцов кДНК. Удаление
рибосомальной РНК перед полномасштабным секвенированием транскриптомов прокариот.251
ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………………………….......266
ВЫВОДЫ….………………………………………………………………………………………....270
Список сокращений и условных обозначений…..…………………………….....….…....….…....271
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…..……………………………………………………………..………...273
