СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ....................................................... 6
ВВЕДЕНИЕ ....................................................................................................................................... 8
Актуальность темы исследования................................................................................................. 8
Степень разработанности темы................................................................................................... 10
Цель и задачи ............................................................................................................................... 11
Задачи, решаемые в ходе исследования:..................................................................................... 11
Научная новизна .......................................................................................................................... 12
Теоретическая и практическая значимость работы.................................................................... 13
Методология и методы исследования......................................................................................... 14
Положения, выносимые на защиту ............................................................................................. 14
Степень достоверности результатов ........................................................................................... 15
Апробация результатов................................................................................................................ 16
Соответствие диссертации паспорту научной специальности................................................... 16
Личный вклад автора в проведение исследования ..................................................................... 16
Публикации.................................................................................................................................. 17
Структура и объем диссертации.................................................................................................. 17
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................. 18
1.1 Эпилепсия............................................................................................................................... 18
1.1.1 Определение и эпидемиология эпилепсии ..................................................................... 18
1.1.2 Современная классификация эпилепсии ........................................................................ 19
1.1.3 Моногенные эпилепсии................................................................................................... 20
1.2 Ген SCN1A .............................................................................................................................. 24
1.2.1 Структура, экспрессия и функция гена SCN1A .............................................................. 24
1.2.2 Регуляция экспрессии гена SCN1A ................................................................................. 27
1.2.3 Менделирующие SCN1A-ассоциированные фенотипы.................................................. 28
1.3 Сплайсинг и моногенные заболевания.................................................................................. 35
1.3.1 Основные этапы прохождения сплайсинга .................................................................... 35
1.3.2 Распознавание экзонов и интронов и роль регуляторных элементов............................ 37
1.3.3 Нарушение сплайсинга как причина развития моногенных заболеваний..................... 41
1.3.4 Экспериментальное подтверждение влияния вариантов нуклеотидной
последовательности на прохождение сплайсинга .................................................................. 46
1.4 Псевдоэкзоны в норме и при патологии ............................................................................... 50
3
1.4.1 Псевдоэкзоны в норме..................................................................................................... 50
1.4.2 Псевдоэкзоны при патологии.......................................................................................... 51
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................................... 54
2.1 Пациенты................................................................................................................................ 54
2.2 Номенклатура вариантов нуклеотидной последовательности и оценка патогенности....... 54
2.3 Материалы исследования ...................................................................................................... 54
2.4 Методы исследования............................................................................................................ 56
2.4.1 Биоинформатические методы ......................................................................................... 56
2.4.2 Методы работы с прокариотическими клетками штамма E.coli XL10-Gold................. 58
2.4.3 Методы работы с эукариотическими клетками линии HEK293T.................................. 60
2.4.4 Исследование влияния вариантов нуклеотидной последовательности на прохождение
сплайсинга с использованием системы экспрессии минигенов ............................................. 62
2.4.5 Создание плазмид с модифицированными антисмысловыми U7-мяРНК для
подавления включения псевдоэкзонов гена SCN1A................................................................ 80
2.4.6 Методы статистического анализа ................................................................................... 82
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................ 84
3.1 Оценка доли вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A потенциально
влияющих на прохождение сплайсинга...................................................................................... 84
3.1.1 Анализ мутационного спектра всех описанных вариантов нуклеотидной
последовательности в гене SCN1A .......................................................................................... 84
3.1.2 Биоинформатический анализ всех описанных вариантов нуклеотидной
последовательности в гене SCN1A на предмет нарушения прохождения сплайсинга.......... 85
3.2 Разработка системы плазмидных векторов, экспрессирующих мини/миди/максигены
SCN1A........................................................................................................................................... 89
3.2.1 Создание векторов для исследования сплайсинга.......................................................... 89
3.2.2 Дизайн и создание плазмидных векторов, экспрессирующих мини/мидигены SCN1A90
3.2.3 Тестирование плазмидных векторов, экспрессирующие мини/мидигены SCN1A........ 91
3.2.4 Применение подходов по улучшению распознавания экзонов гена SCN1A в составе
минигенов ................................................................................................................................. 93
3.2.5 Итоги разработки системы плазмидных векторов, экспрессирующих
мини/миди/максигены SCN1A................................................................................................ 106
3.3 Исследование влияния интронных вариантов нуклеотидной последовательности на
прохождение сплайсинга в гене SCN1A.................................................................................... 111
3.4 Исследование влияния экзонных вариантов нуклеотидной последовательности на
прохождение сплайсинга в гене SCN1A.................................................................................... 119
3.5 Функциональный анализ вариантов нуклеотидной последовательности, влияющих на
прохождение сплайсинга в гене SCN1A, выявленных у российских пациентов..................... 123
3.6 Исследование псевдоэкзонов гена SCN1A и их участия в патогенезе SCN1Aассоциированной эпилепсии ..................................................................................................... 128
4
3.6.1 Разработка и валидация системы по экспрессии минигена для псевдоэкзона 4 гена
SCN1A ..................................................................................................................................... 128
3.6.2 Разработка и валидация системы по экспрессии минигена для псевдоэкзона 23 гена
SCN1A ..................................................................................................................................... 132
3.6.3 Разработка и валидация системы по экспрессии минигена для псевдоэкзона 25 гена
SCN1A ..................................................................................................................................... 134
3.6.4 Подавление включения псевдоэкзонов гена SCN1A с помощью модифицированных
антисмысловых U7-мяРНК.................................................................................................... 135
3.7 Гено-фенотипические корреляции в гене SCN1A с учетом данных функционального
анализа........................................................................................................................................ 140
3.7.1 Анализ распределения миссенс вариантов, не предсказывающихся как влияющие на
сплайсинг, и «миссенс» вариантов, потенциально влияющих на прохождение сплайсинга,
относительно структуры белка Nav1.1.................................................................................. 140
3.7.2 Сравнение тяжести SCN1A-ассоциированных фенотипов среди пациентов с
различными типами вариантов нуклеотидной последовательности.................................... 142
3.8 Оценка чувствительности и специфичности различных биоинформатических
алгоритмов предсказания влияния вариантов нуклеотидной последовательности на сплайсинг
………………………………………………………………………………………………146
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................................. 150
ВЫВОДЫ....................................................................................................................................... 153
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ........................................................................................ 155
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ............................................................. 156
Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки
России......................................................................................................................................... 156
Список публикаций в других изданиях .................................................................................... 156
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................................. 157
ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................................................................................. 176
Приложение А Список всех описанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене
SCN1A, предсказанных биоинформатическим алгоритмом SpliceAI как влияющие на
сплайсинг ................................................................................................................................... 176
Приложение Б Биоинформатические предсказания и результаты функционального анализа 68
интронных вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A............................... 193
Приложение В Результаты функционального анализа 68 интронных вариантов нуклеотидной
последовательности в гене SCN1A............................................................................................ 204
Приложение Г Биоинформатические предсказания и результаты функционального анализа 21
экзонного варианта нуклеотидной последовательности в гене SCN1A................................... 224
Приложение Д Результаты функционального анализа 21 экзонного варианта нуклеотидной
последовательности в гене SCN1A............................................................................................ 228
Приложение E Биоинформатические предсказания и результаты функционального анализа 8
ранее неописанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A, выявленные
у российских пациентов ............................................................................................................ 238
5
Приложение Ж Список всех выявленных в базе данных gnomAD вариантов нуклеотидной
последовательности в окрестностях ПЭ гена SCN1A с результатами биоинформатического
анализа........................................................................................................................................ 239
Приложение З Список всех экзонных вариантов нуклеотидной последовательности в гене
SCN1A, предсказанных биоинформатическим алгоритмом SpliceAI как влияющие на
сплайсинг по результатам in silico мутагенеза ......................................................................... 250
