СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................. 4
1. ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................6
Актуальность темы исследования.....................................................................6
Цели и задачи исследования............................................................................10
Для достижения цели поставлены следующие задачи:................................ 10
Научная новизна и практическая значимость исследования........................10
Методология и методы исследования.............................................................12
Положения, выносимые на защиту.................................................................13
Апробация результатов.................................................................................... 13
Личное участие автора в проведении исследований.....................................15
Структура и объем диссертации..................................................................... 16
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................17
2.1. Миодистрофия Дюшенна: общие сведения............................................ 17
2.2. Молекулярные механизмы развития заболевания..................................18
2.3. Терапевтические подходы для лечения МДД......................................... 25
2.3.1. Пропуск экзонов................................................................................26
2.3.2. Игнорирование нонсенс-мутаций....................................................28
2.3.3. Вирусная доставка укороченных форм микродистрофина и
микроутрофина............................................................................................ 29
2.3.5. Клеточная терапия.............................................................................31
2.3.6. Другие подходы................................................................................. 32
2.4. Моделирование МДД................................................................................ 33
2.5. Редактирование генома с помощью Cas белков......................................38
2.6. CRISPR-Cas9 для создания моделей........................................................43
2.7. CRISPR-Cas9 в качестве терапевтического агента.................................47
2.8. Аденоассоциированные вирусы для генной терапии............................ 55
2.9. Особенности разработки генной терапии для уникальных мутаций в
гене дистрофина............................................................................................... 59
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................... 60
3.1. Пациенты....................................................................................................60
3.2. Трансдифференцировка фибробластов в миоциты................................ 60
3.3. Лабораторные животные...........................................................................61
3.4. Микроинъекции, культивирование эмбрионов и перенос.....................62
3.5. Получение компонентов для редактирования генома в мышиных
эмбрионах..........................................................................................................63
3.6. Получение плазмид, продукция и очистка рекомбинантных
3
аденоассоциированных вирусов..................................................................... 64
3.7. Культура первичных миобластов из скелетных мышц модельных
мышей и скрининг препаратов ААV для редактирования генома.............. 66
3.8. Введение мышам вирусных препаратов..................................................67
3.9. Выделение геномной ДНК, РНК, ПЦР-анализ, анализ
последовательностей........................................................................................67
3.10. Вестерн блоттинг.....................................................................................71
3.11. Иммунофлуоресцентный анализ криосрезов........................................72
3.12. Физиологические тесты..........................................................................73
3.13. Биохимические тесты..............................................................................75
3.14. Гистологический анализ......................................................................... 75
3.15. Статистический анализ........................................................................... 76
4. РЕЗУЛЬТАТЫ...................................................................................................76
4.1. Анализ уникальной мутации, выявленной у пациента с
миодистрофией Дюшенна............................................................................... 76
4.2. Подбор РНК-гидов для внесения делеции экзонов 8-34 в мышиной ген
Dmd.................................................................................................................... 81
4.3. Получение мышей с делецией экзонов 8-34 в гене дистрофина...........84
4.4. Выведение линии модельных мышей DMDdel8-34............................... 88
4.5. Описание фенотипа линии мышей DMDdel8-34....................................90
4.6. Восстановление рамки считывания дистрофина в миоцитах мышей
DMDdel8-34 c помощью комплексов CRISPR-Cas9 in vitro.........................99
4.7. Внутримышечное введение препаратов AAV-CRISPR приводит к
восстановлению рамки считывания дистрофина и мышечной функции в
мышах DMDdel8-34....................................................................................... 105
4.8. Экспрессия укороченной формы дистрофина приводит к
восстановлению DAGC у мышей DMDdel8-34........................................... 111
4.9. Целевое и нецелевое разрезание ДНК комплексом CRISPR-Cas9..... 113
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................ 117
6. ВЫВОДЫ........................................................................................................ 122
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................123
ПРИЛОЖЕНИЕ 1................................................................................................ 143
ПРИЛОЖЕНИЕ 2................................................................................................ 144
ПРИЛОЖЕНИЕ 3................................................................................................ 145
БЛАГОДАРНОСТИ.............................................................................................149
