ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ .............................................................................................................................. 2
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................... 5
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ....................................................................................... 18
1.1 Внутренне неупорядоченные белки .................................................................................... 18
1.1.1 Казеины ............................................................................................................................ 21
1.1.2 Рекомбинантный аналог лактаптина RL2..................................................................... 23
1.2 Изучение внутренне неупорядоченных белков методами магнитного резонанса ......... 25
1.2.1 ЯМР спектроскопия ........................................................................................................ 25
1.2.1.1 Отличия между глобулярными белками и IDP на спектрах ЯМР .................... 26
1.2.1.2 Остаточная вторичная структура IDP по данным химических сдвигов .......... 28
1.2.1.3 Динамика основной цепи белка по данным 15N R1, R2
и 1H- 15N NOE ............. 29
1.2.1.4 Остаточная третичная структура IDP по данным PRE ...................................... 35
1.2.2 ЭПР спектроскопия ......................................................................................................... 40
1.2.2.1 Динамика белков по данным стационарной спектроскопии ЭПР .................... 40
1.2.2.2 Определение пространственной структуры белка по данным PELDOR ......... 43
1.3 Эксцизионная репарация оснований ................................................................................... 45
1.3.1 8-оксогуанин .................................................................................................................... 45
1.3.2 Репарация повреждения 8-оксогуанин ......................................................................... 46
1.4 Динамика открытия-закрытия пар оснований в ДНК. Катализируемый протонный обмен
....................................................................................................................................................... 47
1.5 Заключение ............................................................................................................................ 49
ГЛАВА 2. ПОВЕДЕНИЕ RL2 В РАСТВОРЕ И В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ПО ДАННЫМ
МЕТОДОВ МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА.............................................................................. 51
2.1 Введение ................................................................................................................................. 51
2.2 Экспериментальная часть ..................................................................................................... 52
2.2.1 Особенности структуры и организации RL2 в растворе по данным методов магнитного
резонанса ................................................................................................................................... 52
3
2.2.2 Поведение RL2 в клетках A549 в процессе его проникновения по данным ЭПР и
конфокальной микроскопии ................................................................................................... 54
2.3 Особенности структуры и организации RL2 в растворе по данным методов магнитного
резонанса ...................................................................................................................................... 58
2.3.1 Влияние pH на агрегацию RL2 в растворе по данным ЭПР ....................................... 58
2.3.2 Влияние pH на спектры ЯМР RL2 ................................................................................ 60
2.3.3 Отнесение сигналов ЯМР основной цепи RL2 в растворе ......................................... 62
2.3.4 Динамика основной цепи RL2 в растворе по данным 15N R1, R2, 1H–15N NOE ........ 66
2.3.5 Остаточная третичная структура RL2 в растворе по данным PRE ............................ 68
2.4 Поведение RL2 в клетках A549 в процессе его проникновения по данным ЭПР и
конфокальной микроскопии ....................................................................................................... 69
2.4.1 Введение в RL2 спиновых меток для внутриклеточных экспериментов ЭПР ......... 69
2.4.2 Поведение sRL2 в культуральной среде для инкубирования клеток ........................ 72
2.4.3 Проникновение sRL2 в клетки A549 по данным ЭПР ................................................ 75
2.4.4 Локализация флуоресцентного конъюгата RL22 в клетках A549 по данным
конфокальной микроскопии ................................................................................................... 78
2.4.5 Влияние ингибитора эндоцитоза на проникновение sRL2 в клетки A549 ................ 81
2.4.6 Кинетика разрушения агрегатов RL22 в клетках A549 ............................................... 83
2.5 Заключение ............................................................................................................................ 85
ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИНАМИКИ ОТКРЫТИЯ – ЗАКРЫТИЯ ПАР ОСНОВАНИЙ,
СОДЕРЖАЩИХ ПОВРЕЖДЕНИЕ 8-ОКСОГУАНИН .......................................................... 86
3.1 Введение ................................................................................................................................. 86
3.2 Экспериментальная часть ..................................................................................................... 88
3.2.1 Адаптация последовательности CLEANEX-PM для измерения констант скорости обмена
иминопротонов с протонами воды ......................................................................................... 90
3.2.2 Отнесение сигналов 1H ЯМР иминопротонов.............................................................. 95
3.2.3 Расчет величин kB ........................................................................................................... 97
3.3 Константы скоростей и равновесия процесса открытия – закрытия пар оснований,
содержащих 8-оксогуанин .......................................................................................................... 98
4
3.4 Термодинамические параметры плавления дуплексов ДНК .......................................... 105
3.5 Заключение .......................................................................................................................... 110
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ .................................................................................................... 112
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АББРЕВИАТУР И ТЕРМИНОВ ............................................... 113
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................... 116
ПРИЛОЖЕНИЕ ......................................................................................................................... 133
