ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 24
1.1. Стромальные стволовые клетки и иммунная регуляция 24
1.2. Особенности взаимодействия костной и иммунной систем 33
1.2.1 Использование ССК для остеорегенерации 38
1.3. Остеобласты 40
1.4. Маркеры метаболизма костной ткани 44
1.5. Процесс физиологического ремоделирования кости 46
1.6. Роль паракринных медиаторов ССК в ангиогенезе костной ткани 54
1.7. Гемопоэтические стволовые клетки 58
1.8. Роль экстрацеллюлярного матрикса в жизнедеятельности клеток 62
1.9. Роль искусственного матрикса в механизмах межклеточного
взаимодействия 69
1.10. Влияние 3D-культуры клеток на потенциал костной регенерации
стромальных стволовых клеток
73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 78
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 80
2.1. Объект и материал исследования 80
2.2. Получение культуры иммунокомпетентных клеток из цельной крови
человека
81
2.3. Получение культуры стромальных стволовых клеток из липоаспирата
жировой ткани человека 83
2.4. Оценка жизнеспособности клеточных культур 84
2.5. Подсчет общего числа клеток в экспериментальных культурах 85
2.6. Детекция дифференцировки стромальных стволовых клеток 86
2.7. Проведение фенотипической идентификации выделенного пула
стромальных стволовых клеток
89
2.8. Экспериментальное 2D и 3D культивирование клеток 92
2.8.1. Двухмерная модель культивирования 92
2.8.2. Трехмерная модель культивирования клеток 93
2.8.3. Экспериментальные модели культивирования для выявления
остеогенной дифференцировки стромальных стволовых клеток
96
2.9. Оценка морфофункционального состояния (активации,
дифференцировки, созревания, пролиферации и гибели) клеточных культур в
условиях 2D- и 3D-сокультивирования
98
3
2.9.1. Определение антигенных детерминант 98
2.9.2. Количественное определение медиаторов, секретируемых клетками 100
2.10. Оценка дифференцировки и созревания клеток 102
2.10.1. Определение относительного уровня экспрессии мРНК исследуемых
генов
102
2.10.2. Оценка суммарной площади очагов минерализации и содержания
клеток с морфологией кроветворных в разных экспериментальных культурах
методом компьютерной морфометрии
109
2.10.3. Определение уровня остеокальцина в супернатантах разных
экспериментальных культур методом иммуноферментного анализа 111
2.11. Статистическая обработка результатов 113
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 117
3.1. Количественное определение относительного (%) содержания
жизнеспособных, апоптотических и мертвых форм клеток в разных
экспериментальных культурах в условиях in vitro в присутствии трёхмерных
матриксов с кальций-фосфатным покрытием
117
3.2. Оценка молекул дифференцировки на клеточной поверхности в разных
экспериментальных культурах клеток в условиях in vitro в присутствии
трёхмерных матриксов с кальций-фосфатным покрытием 120
3.3. Анализ продукции медиаторов (хемокинов, про- и
противовоспалительных цитокинов, факторов роста) в разных
экспериментальных культурах клеток в условиях in vitro в присутствии
трёхмерных матриксов с кальций-фосфатным покрытием 128
3.4. Определение уровня относительной экспрессии мРНК генов
дифференцировки в разных экспериментальных культурах клеток в условиях
in vitro в присутствии трёхмерных матриксов с кальций-фосфатным
покрытием 140
3.5. Анализ суммарной площади очагов минерализации в разных
экспериментальных культурах клеток в условиях in vitro в присутствии
трёхмерных матриксов с кальций-фосфатным покрытием 144
3.6. Оценка уровня остеокальцина в супернатантах разных
экспериментальных культур клеток в условиях in vitro в присутствии
трёхмерных матриксов с кальций-фосфатным покрытием 146
3.7. Корреляционные взаимосвязи, обнаруженные между исследуемыми
показателями 147
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 150
4.1. Особенности взаимодействия неприлипающих иммунокомпетентных
клеток и трехмерного матрикса с кальций-фосфатным покрытием,
имитирующим регенерирующую костную ткань, по истечении 48 часов 150
4
культивирования
4.2. Особенности взаимодействия стромальных стволовых клеток с
трехмерным матриксом с кальций-фосфатным покрытием, имитирующим
регенерирующую костную ткань, по истечении 14 и 21 суток
культивирования 160
4.3. Особенности сокультивирования стромальных стволовых и
неприлипающих иммунокомпетентных клеток в присутствии трехмерного
матрикса с кальций-фосфатным покрытием, имитирующим регенерирующую
костную ткань, по истечении 14 и 21 суток культивирования
182
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 198
ВЫВОДЫ 201
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 204
