ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................ 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................. 16
1.1. Структура дистрофина и дистрофин-ассоциированного белкового комплекса и роль в
функционировании мышечной ткани ............................................................................................ 17
1.2. Этиология мышечной дистрофии Дюшенна. Последствия потери функционального
дистрофина при мышечной дистрофии Дюшенна........................................................................ 21
1.2.1. Причины возникновения мышечной дистрофии Дюшенна, проявления патологии и
эпидемиология.............................................................................................................................. 21
1.2.2. Последствия отсутствия дистрофина – вторичные проявления мышечной
дистрофии Дюшенна.................................................................................................................... 24
1.2.2.1. Нарушение механических свойств сарколеммы.................................................. 24
1.2.2.2. Функциональная ишемия ....................................................................................... 25
1.2.2.3. Свободнорадикальное повреждение ..................................................................... 25
1.2.2.4. Нарушение регенерации мышечной ткани........................................................... 26
1.2.3. Нарушение работы ионных каналов сарколеммы при дистрофии Дюшенна .......... 27
1.2.3.1. Дисрегуляция кальциевых каналов сарколеммы при мышечной дистрофии
Дюшенна ................................................................................................................................... 28
1.2.3.2. Дисрегуляция натриевых каналов сарколеммы при мышечной дистрофии
Дюшенна ................................................................................................................................... 33
1.2.3.3. Дисрегуляция калиевых каналов сарколеммы при мышечной дистрофии
Дюшенна ................................................................................................................................... 34
1.2.4. Роль ионных каналов внутриклеточных органелл в развитии мышечной дистрофии
Дюшенна ....................................................................................................................................... 35
1.2.4.1. Нарушение функции каналов саркоплазматического ретикулума при
мышечной дистрофии Дюшенна ............................................................................................ 36
1.2.4.2. Нарушение функции ионных каналов митохондрий при мышечной дистрофии
Дюшенна ................................................................................................................................... 41
1.2.4.3. Взаимодействие саркоплазматического ретикулума и митохондрий при
мышечной дистрофии Дюшенна ............................................................................................ 42
1.2.4.4. Последствия нарушения функции ионных каналов при мышечной дистрофии
Дюшенна ................................................................................................................................... 43
1.3. Роль нарушения метаболизма и митохондриальной дисфункции в развитии мышечной
дистрофии Дюшенна........................................................................................................................ 45
1.3.1. Механизмы метаболической дисфункции при мышечной дистрофии Дюшенна ... 45
3
1.3.2. Роль митохондрий в развитии мышечной дистрофии Дюшенна .............................. 49
1.3.2.1. Нарушение функции митохондрий при мышечной дистрофии Дюшенна ....... 50
1.3.2.2. Нарушение ультраструктуры митохондрий при мышечной дистрофии
Дюшенна ................................................................................................................................... 52
1.3.2.3. Нарушение селективного удаления дефектных митохондрий (митофагии) при
мышечной дистрофии Дюшенна ............................................................................................ 53
1.4. Терапевтические подходы, применяемые для лечения и вспомогательной терапии
мышечной дистрофии Дюшенна .................................................................................................... 55
1.4.1. Терапия, направленная на восстановление уровня и функции дистрофина ............ 55
1.4.2. Терапевтические подходы, основанные на трансплантации клеток......................... 56
1.4.3. Терапия на основе замещения дисфункционального дистрофина............................ 56
1.4.4. Терапевтические подходы, направленные на коррекцию вторичных нарушений,
характерных для мышечной дистрофии Дюшенна................................................................... 57
1.4.4.1. Терапия, направленная на снижение уровня фиброза ........................................ 58
1.4.4.2. Терапия, направленная на подавление воспалительного процесса ................... 59
1.4.4.3. Терапия, направленная на восстановление ионного гомеостаза........................ 61
1.4.4.4. Терапия, направленная на снижение интенсивности окислительного стресса 62
1.4.5. Характеристика дистрофин-дефицитной модели mdx-мышей .................................. 64
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................ 66
2.1. Экспериментальные животные ............................................................................................ 66
2.2. Оценка мышечной силы и выносливости животных......................................................... 67
2.3. Регистрация электрокардиограммы животных .................................................................. 67
2.4. Гистологические исследования............................................................................................ 68
2.5. Просвечивающая электронная микроскопия...................................................................... 68
2.6. Определение уровня ATФ в скелетных мышцах ............................................................... 69
2.7. Выделение РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени 69
2.8. Количественная оценка митохондриальной ДНК.............................................................. 71
2.9. Электрофорез и иммуноблоттинг ........................................................................................ 71
2.10. Выделение и работа с митохондриями ............................................................................ 72
2.10.1. Выделение митохондрий из скелетной мускулатуры мышей ................................... 72
2.10.2. Выделение митохондрий из сердца мышей................................................................. 72
2.10.3. Оценка дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий .................... 73
2.10.4. Оценка активности комплексов дыхательной цепи митохондрий............................ 73
2.10.5. Оценка разности электрических потенциалов (Δψ) на внутренней мембране
митохондрий................................................................................................................................. 75
4
2.10.6. Оценка скорости образования H2O2 митохондриями................................................. 75
2.10.7. Измерение транспорта кальция и кальциевой емкости митохондрий...................... 75
2.10.8. Измерение транспорта K
+ и общего уровня иона в митохондриях........................... 76
2.10.9. Определение уровня липидных перекисей.................................................................. 76
2.10.10. Определение фазового состояния мембран митохондрий ......................................... 76
2.11. Митохондриальная заместительная терапия................................................................... 77
2.11.1. Мечение митохондрий скелетных мышц мыши с помощью MitoTracker Red
CMXRos и введение их животным............................................................................................. 77
2.11.2. Визуализация результатов митохондриальной трансплантации............................... 78
2.12. Статистическая обработка результатов исследований .................................................. 78
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................. 79
3.1. Состояние скелетной и сердечной мускулатуры дистрофин-дефицитных мышей, а
также структура и функционирование митохондрий этих тканей при дистрофии Дюшенна . 79
3.1.1. Дисфункция скелетных мышц при дистрофии Дюшенна сопровождается
нарушением ультраструктуры митохондрий и их функциональной активности.................. 79
3.1.1.1. Развитие мышечной дистрофии характеризуется снижением мышечной силы и
выносливости mdx-мышей, а также нарушением организации скелетных мышц
животных................................................................................................................................... 79
3.1.1.2. Митохондрии скелетных мышц дистрофин-дефицитных мышей
характеризуются снижением эффективности окислительного фосфорилирования, что
сопровождается снижением уровня АТФ в скелетных мышцах......................................... 83
3.1.1.3. Митохондрии скелетных мышц дистрофин-дефицитных мышей
характеризуются увеличением продукции активных форм кислорода и уровня продуктов
перекисного окисления липидов ............................................................................................ 84
3.1.1.4. Митохондрии скелетных мышц mdx-мышей демонстрируют угнетение
системы рециклизации Са2+, обусловленные перестройками в комплексе Са2+
-
унипортера ................................................................................................................................ 85
3.1.1.5. Митохондрии скелетных мышц mdx-мышей проявляют низкую резистентность
к индукции Са2+
-зависимой поры........................................................................................... 89
3.1.1.6. Митохондрии скелетных мышц mdx-мышей демонстрируют снижение
скорости транспорта ионов калия и общего уровня этого иона в органеллах................... 92
3.1.2. Развитие патологии сердечной мышцы при дистрофии Дюшенна сопровождается
адаптационными изменениями функциональной активности митохондрий......................... 94
5
3.1.2.1. Развитие дистрофии Дюшенна сопровождается гипертрофией сердечной
мышцы и электрофизиологическими нарушениями, а также изменением
ультраструктуры ткани............................................................................................................ 94
3.1.2.2. Митохондрии сердца дистрофин-дефицитных мышей характеризуются
увеличением эффективности окислительного фосфорилирования и повышением
продукции активных форм кислорода ................................................................................... 99
3.1.2.3. Митохондрии сердца mdx-мышей характеризуются увеличением
эффективности рециклизации Са2+, что обусловлено перестройками в комплексе
кальциевого унипортера и Na+
/Са2+
-антипорта................................................................... 101
3.1.2.4. Митохондрии сердца mdx-мышей демонстрируют повышение устойчивости к
индукции Са2+
-зависимой поры............................................................................................ 104
3.1.2.5. Митохондрии сердца mdx-мышей характеризуются снижением скорости
транспорта ионов калия и общего уровня иона .................................................................. 108
3.1.3. Заключение по главе 3.1 .............................................................................................. 109
3.2. Влияние глюкокортикоида дефлазакорта на развитие митохондриальной дисфункции и
состояние скелетной мускулатуры при дистрофии Дюшенна .................................................. 111
3.2.1. Влияние дефлазакорта на параметры дыхания и окислительного
фосфорилирования митохондрий скелетных мышц экспериментальных групп мышей ... 113
3.2.2. Влияние дефлазакорта на поглощение Са2+ митохондриями скелетных мышц
экспериментальных групп мышей............................................................................................ 115
3.2.3. Влияние дефлазакорта на индукцию Са2+
-зависимой поры в митохондриях
скелетных мышц экспериментальных групп мышей ............................................................. 117
3.2.4. Влияние дефлазакорта на состояние скелетных мышц mdx-мышей, а также на
мышечную силу и выносливость животных ........................................................................... 119
3.2.5. Заключение по главе 3.2 .............................................................................................. 123
3.3. Влияние метаболического модулятора уридина на состояние скелетной мускулатуры и
сердца и функционирование митохондрий этих органов при дистрофии Дюшенна.............. 124
3.3.1. Влияние уридина на состояние скелетной мускулатуры и дисфункцию
митохондрий при дистрофии Дюшенна .................................................................................. 126
3.3.1.1. Влияние уридина на соматические и биохимические характеристики мышей и
состояние скелетных мышц .................................................................................................. 126
3.3.1.2. Влияние уридина на ультраструктуру митохондрий скелетных мышц мышей . 129
3.3.1.3. Влияние уридина на экспрессию генов, ответственных за митохондриальную
динамику, биогенез и митофагию в скелетных мышцах ................................................... 130
6
3.3.1.4. Влияние уридина на функционирование митохондрий скелетных мышц
дистрофин-дефицитных мышей ........................................................................................... 132
3.3.2. Влияние уридина на состояние сердца и функцию митохондрий этого органа при
дистрофии Дюшенна.................................................................................................................. 134
3.3.2.1. Влияние уридина на гистологическую структуру сердечной мышцы и
ультраструктуру ткани при дистрофии Дюшенна .............................................................. 134
3.3.2.2. Влияние уридина на ультраструктуру митохондрий сердца............................ 136
3.3.2.3. Влияние уридина на функционирование митохондрий сердца
дистрофин-дефицитных мышей ........................................................................................... 138
3.3.3. Заключение по главе 3.3 .............................................................................................. 141
3.4. Влияние активации митохондриального, активируемого ионами кальция калиевого
канала производным бензимидазола NS1619 на состояние скелетной мускулатуры и сердца и
функционирование митохондрий этих органов при дистрофии Дюшенна ............................. 142
3.4.1. Влияние NS1619 на дисфункцию митохондрий и состояние скелетных мышц при
дистрофии Дюшенна.................................................................................................................. 143
3.4.1.1. NS1619 подавляет дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий
скелетных мышц mdx-мышей и животных дикого типа .................................................... 143
3.4.1.2. NS1619 нормализует скорость транспорта калия и общий уровень иона в
митохондриях скелетных мышц mdx-мышей...................................................................... 144
3.4.1.3. NS1619 увеличивает кальциевую емкость митохондрий и снижает
интенсивность окислительного стресса в скелетных мышцах mdx-мышей..................... 146
3.4.1.4. NS1619 нормализует ультраструктуру митохондрий скелетных мышц
mdx-мышей, но не влияет на экспрессию генов ответственных за митохондриальный
биогенез, динамику и митофагию ........................................................................................ 148
3.4.1.5. NS1619 снижает интенсивность деструктивных процессов в скелетных
мышцах mdx-мышей .............................................................................................................. 152
3.4.2. Влияние NS1619 на функцию митохондрий и состояние ткани сердца при
дистрофии Дюшенна.................................................................................................................. 155
3.4.2.1. NS1619 улучшает транспорт ионов калия и увеличивает содержания иона в
митохондриях сердца дистрофин-дефицитных мышей ..................................................... 155
3.4.2.2. NS1619 не влияет на дыхание митохондрий сердца mdx-мышей и кальциевую
емкость, но снижает уровень перекисного окисления липидов........................................ 157
3.4.2.3. NS1619 нормализует ультраструктуру митохондрий сердца mdx-мышей...... 158
3.4.2.4. NS1619 уменьшает площадь фиброза в сердце mdx-мышей ............................ 161
7
3.4.3. Влияние NS1619 на функциональную активность изолированных митохондрий
скелетных мышц мышей ........................................................................................................... 162
3.4.4. Заключение по главе 3.4 .............................................................................................. 167
3.5. Влияние ингибирования Са2+
-зависимой поры на состояние скелетной мускулатуры и
сердца и функционирование митохондрий этих органов при дистрофии Дюшенна.............. 168
3.5.1. Влияние алиспоривира на дисфункцию митохондрий и состояние скелетных мышц
при дистрофии Дюшенна .......................................................................................................... 170
3.5.1.1. Алиспоривир снижает чувствительность митохондрий скелетных мышц к
индукции Ca2+
-зависимой поры и улучшает функционирование органелл mdx-мышей 170
3.5.1.2. Алиспоривир подавляет митохондриальную динамику и биогенез в скелетной
мускулатуре mdx-мышей, а также митофагию.................................................................... 177
3.5.1.3. Влияние алиспоривира на ультраструктуру митохондрий скелетной
мускулатуры мышей .............................................................................................................. 179
3.5.1.4. Алиспоривир снижает интенсивность воспалительного процесса и улучшает
мышечную функцию mdx-мышей......................................................................................... 182
3.5.2. Влияние алиспоривира на функционирование митохондрий и состояние ткани
сердца при дистрофии Дюшенна.............................................................................................. 184
3.5.2.1. Влияние алиспоривира на функционирование митохондрий сердца мышей. 184
3.5.2.2. Влияние алиспоривира на митохондриальный биогенез, динамику органелл и
митофагию в сердечной мускулатуре .................................................................................. 189
3.5.2.3. Влияние алиспоривира на ультраструктуру митохондрий сердца мышей ..... 190
3.5.2.4. Влияние алиспоривира на некоторые параметры сердечной мышцы............. 193
3.5.3. Влияние алиспоривира на функциональную активность изолированных
митохондрий скелетных мышц................................................................................................. 195
3.5.4. Заключение по главе 3.5 .............................................................................................. 199
3.6. Применение митохондриальной заместительной терапии для коррекции дистрофии
Дюшенна ......................................................................................................................................... 201
3.6.1. Влияние митохондриальной заместительной терапии на состояние ткани
скелетных мышц mdx-мышей и мышечную силу животных................................................. 203
3.6.2. Влияние митохондриальной заместительной терапии на функционирование
митохондрий скелетных мышц mdx-мышей............................................................................ 209
ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................ 212
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.............................................. 219
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................. 221
