СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ. .............................................................................................................................8
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ..........................................................................................................17
2.1 Внеклеточные везикулы как источник потенциальных биологических маркеров
заболеваний ................................................................................................................................17
2.1.1 Внеклеточные везикулы. Определение и история исследований ........................17
2.1.2 Биология внеклеточных везикул. Биогенез и свойства. ........................................19
2.1.3 Молекулярный состав ВнВ. ......................................................................................25
2.1.4 Биологические функции внеклеточных везикул ....................................................29
2.2 Методы выделения внеклеточных везикул и подходы к их анализу ..........................31
2.2.1 Актуальные методы выделения внеклеточных везикул ........................................31
2.2.2 Методы анализа внеклеточных везикул. .................................................................36
2.3 Внеклеточные везикулы в контексте онкологических заболеваний ..........................38
2.3.1 Рак легких ...................................................................................................................39
2.3.2 Рак прямой кишки .....................................................................................................42
2.3.3 Рак молочной железы ................................................................................................44
2.3.4 Рак предстательной железы ......................................................................................45
2.3.5 Рак яичника ................................................................................................................46
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................................................48
3.1 Культивирование модельных клеточных линий и получение клинического
материала (сыворотки и плазмы крови человека) ..................................................................48
3.1.1 Культивирование модельных клеточных линий АКЛ и КРР ...............................48
3.1.2 Получение сыворотки и плазмы крови от здоровых доноров и пациентов с АКЛ
и КРР 49
3
3.2 Методы выделения ВнВ из среды культивирования клеточных линий АКЛ и КРР,
сыворотки и плазмы крови .......................................................................................................50
3.2.1 Выделение препаратов ВнВ методом УЦ ...............................................................50
3.2.2 Выделение препаратов ВнВ методом УЦ в градиенте плотности сахарозы .......51
3.2.3 Выделение ВнВ с использованием коммерческого набора Total Exosome
Isolation Kit (from serum) .......................................................................................................51
3.2.4 Выделение препаратов ВнВ с использованием коммерческого набора Total
Exosome Isolation Kit (from serum) с последующей метанол-хлороформной экстракцией
52
3.3 Криоэлектронная микроскопия образцов ВнВ ..............................................................52
3.4 Пробоподготовка к протеомному анализу ....................................................................53
3.4.1 Гидролитическое ферментативное расщепление белков в растворе ...................53
3.4.2 Гидролитическое ферментативное расщепление белков на концентрирующих
фильтрах .................................................................................................................................54
3.4.3 Гидролитическое ферментативное расщепление белков по протоколу S-trap ...54
3.5 Протеомный анализ полученных образцов ...................................................................55
3.5.1 Панорамный протеомный анализ ............................................................................56
3.5.2 Синтез изотопно-меченых внутренних стандартов (SIS) ......................................57
3.5.3 Направленный масс-спектрометрический анализ образцов методом SRM
(мониторинг выбранных реакций) в нанопотоковом режиме с использованием TSQ
Vantage ....................................................................................................................................57
3.5.4 Направленный масс-спектрометрический анализ образцов методом SRM
(мониторинг выбранных реакций) в микропотоковом режиме с использованием TSQ
Quantiva ...................................................................................................................................59
3.6 Биоинформатический анализ масс-спектрометрических данных ...............................60
4
3.6.1 Обработка масс-спектрометрических данных: идентификация белков и
относительный количественный анализ без использования изотопных меток в
программном обеспечении MaxQuant .................................................................................60
3.6.2 Обработка масс-спектрометрических данных: идентификация белков в
программном обеспечении SearchGUI ................................................................................60
3.6.3 Методы визуализации данных и их биологическая аннотация ............................61
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ........................................................................................................................62
4.1 Основные результаты работы .........................................................................................62
4.1.1 Оптимизация метода выделения внеклеточных везикул для последующего
протеомного анализа под контролем мониторинга выбранных реакций (SRM) ............63
4.1.2 Валидация морфологии ВнВ, полученных из клеточных линий АКЛ и КРР, и их
специфического молекулярного состава .............................................................................65
4.1.3 Результаты панорамного масс-спектрометрического анализа образцов ВнВ,
полученных из клеточных линий АКЛ и КРР ....................................................................69
4.1.4 Результаты направленного масс-спектрометрического анализа образцов ВнВ и
ЦЛ, полученных из клеточных линий АКЛ и КРР .............................................................88
4.1.5 Результаты таргетного масс-спектрометрического анализа клинических
образцов, полученных от пациентов с АКЛ и КРР ............................................................92
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ...................................................................................... 114
5.1 Оптимизация метода выделения внеклеточных везикул для последующего
протеомного анализа под контролем мониторинга выбранных реакций (SRM) ............. 114
5.2 Панорамный масс-спектрометрический анализ образцов ВнВ, выделенных из
клеточных линий АКЛ и КРР ................................................................................................ 116
5.3 Направленный масс-спектрометрический анализ образцов ВнВ и ЦЛ, полученных
из клеточных линий АКЛ и КРР и клинического материала. ............................................ 121
5.3.1 Верификация ВнВ-ассоциированных белков в образцах крови, полученных от
пациентов с АКЛ и от здоровых добровольцев ............................................................... 121
5
5.3.2 Биологическая роль компонентов протеомной сигнатуры ВнВ ассоциированной
с РЛ 123
5.3.3 Верификация ВнВ-ассоциированных белков в образцах крови, полученных от
пациентов с КРР и от здоровых добровольцев ................................................................ 127
5.3.4 Протеомные сигнатуры как потенциальные мишени для фармакологического
воздействия .......................................................................................................................... 130
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................... 132
7. ВЫВОДЫ ............................................................................................................................. 134
8. ФИНАНСИРОВАНИЕ ....................................................................................................... 135
9. БЛАГОДАРНОСТИ ............................................................................................................ 136
10. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................... 137
11. ПРИЛОЖЕНИЕ А ............................................................................................................. 159
12. ПРИЛОЖЕНИЕ Б ............................................................................................................. 169
13. ПРИЛОЖЕНИЕ В ............................................................................................................. 170
