ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................................................4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................................12
1.1 Атеросклероз сонных артерий и его осложнения: определение, патогенез на молекулярном
уровне ....................................................................................................................................................12
1.2 Стабильное и нестабильное состояние атеросклеротической бляшки ......................................16
1.3 Изменение экспрессии микроРНК при нестабильном течении атеросклероза.........................23
1.4 Метилирование регуляторных элементов генов микроРНК при атеросклерозе артерий
различной локализации ........................................................................................................................27
Заключение ...........................................................................................................................................34
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................36
2.1 Дизайн исследования ......................................................................................................................36
2.2 Характеристика включенных в исследование выборок ..............................................................37
2.3 Формирование банка тканей и гистологическое исследование атеросклеротических бляшек
сонных артерий .....................................................................................................................................40
2.4 Анализ уровня метилирования в области генов микроРНК и их регуляторных элементов ..43
2.4.1 Выделение ДНК ................................................................................................................43
2.4.2 Бисульфитная модификация ДНК ..................................................................................43
2.4.3 Анализ метилирования ДНК (микрочипы) ....................................................................43
2.4.4 Выбор регуляторных элементов генов микроРНК – кандидатов в отношении
формирования атеросклеротических бляшек с нестабильным течением для анализа
уровня метилирования ДНК .....................................................................................................46
2.4.5 Анализ метилирования ДНК (таргетное бисульфитное секвенирование) ..................51
2.5 Методы исследования для анализа экспрессии микроРНК ........................................................55
2.5.1 Выделение РНК ................................................................................................................55
2.5.2 Секвенирование микроРНК (miRNA-seq) ......................................................................55
2.5.3 Биоинформатический анализ данных .............................................................................56
2.6 Статистический анализ ...................................................................................................................56
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ....................................................................................58
3.1 Уровень метилирования регуляторных элементов отдельных генов микроРНК в
атеросклеротических бляшках и интактных сосудах, а также в лейкоцитах крови пациентов с
атеросклерозом сонных артерий и контрольной группы ..................................................................58
3.1.1 Анализ уровня метилирования CpG-островка гена MIR10B ........................................58
3.1.2 Анализ уровня метилирования регуляторных элементов гена MIR21 ........................70
3.1.2.1 Предполагаемый промоторный регион гена MIR21 .............................................70
3
3.1.2.2 CpG-островок в области гена MIR21 ......................................................................74
3.1.2.3 «Тело» гена MIR21 ...................................................................................................77
3.1.3 Анализ уровня метилирования регуляторного элемента E-box гена MIR100 ............85
3.1.4 Анализ уровня метилирования CpG-островка и гена MIR127 .....................................90
3.1.5 Анализ уровня метилирования гена MIR143 ...............................................................102
3.1.5.1 Предполагаемый промоторный регион MIR143HG (CARMN) ...........................102
3.1.5.2 «Тело» гена MIR143 ...............................................................................................106
3.2 Сравнительный анализ уровня метилирования CpG-сайтов широкого спектра генов
микроРНК в атеросклеротических бляшках сонных артерий в зависимости от степени их
нестабильности с помощью метилочипов Illumina ..........................................................................114
3.3 Уровень метилирования CpG-сайтов генов микроРНК и экспрессия данных молекул в
атеросклеротических бляшках сонных артерий...............................................................................125
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................................................142
ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................152
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................................................154
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................................155
ПРИЛОЖЕНИЕ А ...............................................................................................................................176
ПРИЛОЖЕНИЕ Б ...............................................................................................................................182
ПРИЛОЖЕНИЕ В ...............................................................................................................................186
ПРИЛОЖЕНИЕ Г ...............................................................................................................................191
ПРИЛОЖЕНИЕ Д ...............................................................................................................................203
