Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Перенос генетического материала у прокариот 10
1.2 Агробактериальный перенос ДНК 12
1.2.1 Распознавание растительной клетки-реципиента 14
1 1.2.2 Трансформация и ядерный транспорт Т-ДНК 16
1.2.3. Биологическое значение агробактериальной трансформации 21
1.3. Горизонтальный перенос генов от прокариот в эукариотические клетки, возможно, имеет эволюционное значение 22
1.4. Эмбриональное развитие морских ежей 25
1.4.1. Бластуляция морских ежей 25
1.4.2. Процесс гаструляции 26
1.4.3. Появление и развитие мезенхимного паттерна 28
1.4.4. Клеточные взаимодействия, определяющие дифференцировку и развитие t 29
1.4.5. Молекулярная регуляция событий, происходящих на ранних эмбриональных стадиях 30
1.4.6. Использование универсального активатора транскрипции дрожжей геяа gal4 34
ГЛАВА 2. Материал и методика 36
2.1. Животные 36
2.2. Трансформация оплодотворенных яйцеклеток 36
2.2.1. Бактериальные штаммы иплазмиды 36
2.2.2. Выделение плазмиды 37
2.2.3. Трансформация плазмидой, содержащей ген универсального активатора транскрипции gal4 37
2.2.4. Агробактериальная трансформация эмбрионов 37
2.3. Измерение числа агробактерий в ходе совместного культивирования с эмбрионами морских ежей 39
2.4. Измерение рН морской воды в ходе совместного культивирования агробактерий и эмбрионов морских ежей 40
2.5. Световая и трансмиссионная электронная микроскопия 41
2.6. ДНК- и РНК-анализ 41
2.6.1.Пцриотпцр 41
2.6.2. «TAIL» ПЦР 44
2.6.3. Клонирование и секвенирование 45
2.7. Выявление включения 5-бромо-2-дезоксиуридина в эмбрионах морских ежей 46
2.7. Статистический анализ 47
ГЛАВА 3. Результаты 48
3.1. Жизнеспособность агробактерий в морской воде 48
3.2. Прикрепление агробактерий к клеткам эмбрионов морских ежей 50
3.3.1. Наличие и экспрессия генов rol в трансформированных эмбрионах ... 52
3.3.2. Доказательство встройки Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей 53
3.4. Появление и возможные причины формирования опухолеподобных
структур (ОПС) у эмбрионов морских ежей 55
3.4.1. Процент ОПС при трансформации геном gal4 и растительными онкогенами rolB и rolC 55
3.4.2. Уменьшение числа ОПС при использовании конструкций, несущих мутантные гены vir 59
3.4.3. Изменение рН морской воды в ходе совместного культивирования агробактерий и эмбрионов морских ежей 60
3.5. Строение эмбрионов с опухолеподобными структурами 63
3.5.1. Внешний вид эмбрионов с опухолеподобными структурами 63
3.5.2. Строение и ультраструктура эмбрионов с ОПС 65
3.5.2.1 Строение и структура эмбрионов, трансформированных плазмидой рМА563 66
3.5.2.2 Строение и структура эмбрионов с ОПС после агробактериальной трансформации 69
4 3.5.2.3 Включение 5-бромо-2-дезоксиуридина в эмбрионах с ОПС после агробактериальной трансформации 73
ГЛАВА 4. Обсуждение 74
4.1. Жизнеспособность и способность к трансформации Agrobacterium tumefaciens в морской воде 74
4.2. Встройка Т-ДНК агробактерий и экспрессия генов rolB и rolC при совместном культивировании с эмбрионами морских ежей 76
4.3. Появление опухолеподобных структур у эмбрионов обусловлено переносом Т-ДНК агробактерий 78
4.4. Возможное влияние изменения рН морской воды при совместном культивировании A. tumefaciens и эмбрионов морских ежей 79
4.5. Опухолеподобные структуры эмбрионов морских ежей: строение и возможные причины возникновения в результате изменения нормального хода эмбриогенеза 81
4.5.1. Внешний вид и строение опухолеподобных структур 81
Выводы 86
Список литературы
