ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................... 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................. 15
1.1. Природный механизм переноса генов бактериями рода Rhizobium .................. 15
1.1.1. Концепция генетической колонизации растений ......................................... 15
1.1.2. Молекулярный механизм переноса Т-ДНК ................................................... 17
1.1.3. Растительные белки-участники переноса Т-ДНК ......................................... 18
1.2. Представители семейства plast онкогенов ........................................................... 22
1.3. Гены rol .................................................................................................................... 26
1.3.1. Общая характеристика генов rol .................................................................... 26
1.3.2. Ген rolA .............................................................................................................. 28
1.3.3. Ген rolB .............................................................................................................. 30
1.3.4. Ген rolC ............................................................................................................. 33
1.3.5. Ген rolD ............................................................................................................. 35
1.4. Растительные гомологи генов Т-ДНК ................................................................... 36
1.5. Структурная и функциональная организация сигнальных систем растений ... 38
1.6. Кальциевая сигнальная система растений ............................................................ 42
1.6.1. Внутриклеточные токи ионов кальция .......................................................... 42
1.6.2. Кальций-связывающие белки ......................................................................... 45 1.6.3. Кальций-связывающие белки как инструмент генетической инженерии растений....................................................................................................................... 53
1.7. НАДФН-оксидазная сигнальная система растений ............................................. 56
1.7.1. НАДФН-оксидазы: структура и физико-химические свойства .................. 56
1.7.2. Регуляция активности НАДФН-оксидаз ........................................................ 57
1.7.3. Физиологическая роль растительных НАДФН-оксидаз .............................. 59
1.8. Роль активных форм кислорода в сигнальной регуляции .................................. 61
1.8.1. Генерация активных форм кислорода в растительной клетке .................... 61
1.8.2. Система антиоксидантной защиты растительной клетки ............................ 64
1.8.3. Механизм передачи сигналов с участием активных форм кислорода ....... 68
1.8.4. Физиологическая роль в жизнедеятельности растений ............................... 69
3
1.8.5. Роль активных форм кислорода при стрессах различного происхождения ........................................................................................................... 70
1.9. Вторичные метаболиты Arabidopsis thaliana ....................................................... 74
1.9.1. Общая характеристика и основные группы метаболитов............................ 74
1.9.2. Пути биосинтеза вторичных метаболитов .................................................... 78 1.10. Вторичные метаболиты Rubia cordifolia ............................................................. 85
1.10.1. Общая характеристика и основные группы метаболитов .......................... 85
1.10.2. Биосинтез антрахинонов в растениях Rubia cordifolia ............................... 87
1.10.3. Фармакологические свойства ....................................................................... 90
1.11. Вторичные метаболиты Aristolochia manshuriensis ........................................... 91
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .......................................................................................... 94
2.1. Растительный материал, бактерии и плазмиды ................................................... 94
2.2. Создание вектора для анализа внутриклеточной локализации белка RolC ...... 96
2.3. Культивирование и трансформация бактерий ..................................................... 97
2.4. Получение модельных клеточных культур и растений ...................................... 98
2.4.1. Каллусные культуры Rubia cordifolia ............................................................ 98
2.4.2. Каллусные культуры Arabidopsis thaliana ..................................................... 99
2.4.3. Трансгенные растения Arabidopsis thaliana ................................................ 100
2.4.4. Трансформированные корни Aristolochia manshuriensis ............................ 100
2.5. Выделение ДНК, РНК и синтез первой цепи кДНК .......................................... 101
2.6. Химический анализ клеточных культур ............................................................. 102
2.6.1. Анализ вторичных метаболитов Rubia сordifolia ....................................... 102
2.6.2. Анализ вторичных метаболитов Arabidopsis thaliana ................................ 103
2.6.3. Анализ вторичных метаболитов Aristolochia manshuriensis ...................... 105
2.7. Определение фармакологической активности антрахинонов из каллусной культуры Rubia cordifolia ........................................................................................ 106
2.8. Определение фармакологической активности экстрактов из клеточных культур Aristolochia manshuriensis ......................................................................... 107
2.8.1. Антиоксидантная активность экстрактов .................................................... 107
2.8.2. Протиопухолевая активность экстрактов .................................................... 107
2.9. Определение активных форм кислорода (АФК) ................................................ 108
4
2.9.1. Измерение содержания внутриклеточных АФК методом лазерной конфокальной микроскопии .................................................................................... 108
2.9.2. Флуориметрический метод анализ АФК ..................................................... 109
2.10. Определение жизнеспособности клеток растений .......................................... 110
2.11. Анализ содержания восстановленного и окисленного глутатиона методом масс-спектрометрии ................................................................................. 110
2.12. Идентификация генов биосинтеза антрахинонов Rubia cordifolia ................ 111
2.13. Идентификация и анализ генов антиоксидантных ферментов Rubia cordifolia.......................................................................................................... 112
2.14. Идентификация и анализ генов НАДФН оксидаз Rubia cordifolia ................ 113
2.15. Идентификация и анализ генов кальций-зависимых протеинкиназ Rubia cordifolia.......................................................................................................... 115
2.16. Анализ экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени........................ 115
2.17. Определение внутриклеточной локализации белка RolC ............................... 126
2.17.1. Получение и трансформация протопластов .............................................. 126
2.17.2. Визуализация слитого белка RolC-EGFP в живых клетках с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии .......................................... 126
2.18. Статистический анализ ....................................................................................... 127
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................. 128
3.1. Влияние генов rol на биосинтез вторичных метаболитов ................................ 128
3.1.1. Влияние генов rol на рост и биосинтез вторичных метаболитов в каллусных культурах Rubia cordifolia .................................................................... 128
3.1.2. Эффекты генов rolA и rolB в условиях длительного культивирования трансгенных культур Rubia cordifolia .................................................................... 129
3.1.3. Фармакологическая активность антрахинонов из каллусной культуры Rubia cordifolia .......................................................................................................... 137
3.1.4. Влияние генов rol на биосинтез вторичных метаболитов в трансформированных корнях Aristolochia manshuriensis .................................... 140
3.1.5. Фармакологическая активность экстрактов из клеточных культур Aristolochia manshuriensis ........................................................................................ 143
3.1.6. Влияние генов rol на биосинтез вторичных метаболитов в каллусных культурах Arabidopsis thaliana ................................................................................ 148
5
3.1.7. Влияние генов rol на биосинтез вторичных метаболитов в растениях Arabidopsis thaliana .................................................................................................. 157
3.1.8. Обсуждение результатов по влиянию генов rol на биосинтез вторичных метаболитов ........................................................................................... 163
3.2. Влияние генов rol на содержание АФК и устойчивость трансгенных культур к абиотическим стрессам .......................................................................... 169
3.2.1. Продукция АФК и стрессоустойчивость клеток, экспрессирующих ген rolC ...................................................................................................................... 169
3.2.2. Внутриклеточная локализация белка RolC ................................................. 173
3.2.3. Продукция АФК и стрессоустойчивость клеток, экспрессирующих ген rolB ...................................................................................................................... 176
3.2.4. Продукция АФК и стрессоустойчивость клеток, трансформированных pRiA4 ......................................................................................................................... 188
3.2.5. Обсуждение результатов по влиянию генов rol на продукцию АФК и стрессоустойчивость клеток.................................................................................... 191
3.3. Влияние генов rol на экспрессию генов антиоксидантных ферментов ........... 196
3.3.1. Идентификация и анализ генов антиоксидантной системы у растений Rubia cordifolia .......................................................................................................... 196
3.3.2. Экспрессия генов антиоксидантной системы в растении Rubia cordifolia .......................................................................................................... 201
3.3.3. Экспрессия генов антиоксидантных ферментов в трансгенных культурах ................................................................................................................... 203
3.3.4. Обсуждение результатов по влиянию генов rol на гены антиоксидантной системы ....................................................................................... 210
3.4. Влияние генов rol на экспрессию генов НАДФН-оксидазы (Rboh) ................ 213
3.4.1. Идентификация и анализ генов Rboh в растении Rubia cordifolia ............ 213
3.4.2. Влияние стрессовых факторов на экспрессию генов Rboh в каллусной культуре Rubia cordifolia ......................................................................................... 217
3.4.3. Экспрессия генов Rboh в трансгенных культурах ...................................... 219
3.4.4. Обсуждение результатов по влиянию генов rol на гены НАДФН-оксидазы .................................................................................................... 223
6
3.5. Влияние генов rol на экспрессию генов Са2+-зависимых протеинкиназ (CDPK) .............................................................................................. 225
3.5.1. Идентификация и анализ генов CDPK в растении Rubia cordifolia .......... 225
3.5.2. Влияние метилжасмоната на экспрессию CDPK в каллусах Rubia cordifolia .......................................................................................................... 230
3.5.3. Экспрессия CDPK в трансгенных культурах .............................................. 232
3.5.4. Обсуждение результатов по влиянию генов rol на экспрессию CDPK .... 242
3.6. Влияние гена rolB на молекулярный механизм биогенеза микроРНК............ 246
3.7. Влияние гена rolB на экспрессию генов, связанных с гормональной регуляцией и защитой растений ............................................................................. 251
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................ 257
ВЫВОДЫ .......................................................................................................................... 261
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .............................................................................................. 263
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................ 264
