Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Сателлитные клетки как тканеспецифические стволовые клетки взрослого организма 10
1.1.1. Идентификация сателлитных клеток и их концентрация в мышцах 12
1.1.2. Формирование пула сателлитных клеток 18
1.1.3. Роль генов семейства Pax 22
1.1.4. Альтернативные гипотезы происхождения мышечных сателлитных клеток в эмбриогенезе 25
1.2. Дифференцировка сателлитных клеток 27
1.2.1. Активация и асимметричное деление сателлитных клеток. Роль белкового фактора Numb 27
1.2.2. Роль факторов роста в процессе активации, пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток 29
1.2.3. Слияние миобластов и формирование многоядерных миотуб. Роль генов семейства bHLH в регуляции миогенеза 34
1.2.4. Экспрессия мышечных генов и синтез структурных белков мышц в ходе миогенеза 36
1.2. Сходство и различия миогенеза в эмбриональном развитии и при активации сателлитных клеток 39
1.4. Роль Са в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов 40
1.5. Использование клеточных культур для изучения процессов миогенеза in vitro 42
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Объект исследования 45
2.2. Получение и культивирование клеток 45
2.3. Гистологическое окрашивание 46
2.4. Приготовление криостатных срезов 47
2.5. Иммуноцитохимический анализ 47
2.6. Выделение тотальной РНК 49
2.7. Определение концентрации тотРНК в пробе 49
2.8. Выделение мРНК 50
2.8 Синтез кДНК 50
2.9. Конструирование праймеров 51
2.10. Нормировка кДНК библиотек 51
2.11. Полимеразная цепная реакция 52
2.12. Выделение ДНК из агарозного геля 53
2.13. Секвенирование 53
2.14. Подсчет количества сателлитных клеток и миобластов. Статистическая обработка результатов 54
Глава 3. Результаты исследований 55
3.1. Поведение миогенных клеток-предшественников в культуре 55
3.2. Иммуноцитохимическая характеристика культур миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс на разных стадиях онтогенеза 59
3.3. Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток-предшественников 64
3.3.1. Исследование экспрессии гена Рах7 64
3.3.2. Иммуноцитохимический анализ экспрессии десмина и м-кадгерина 66
3.4. Влияние Са2+ на дифференцировку сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro 71
3.5. Темпы дифференцировки миогенных клеток-предшествеников in vitro 74
3.5. Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток-предшественников в ходе дифференцировки 76
3.5.1. Исследование экспрессии гена Рах7 в процессе дифференцировки сателлитных клеток in vitro 76
3.5.2. Анализ экспрессия гена MyoD в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов 77
3.5.3 Анализ экспрессии гена, кодирующего м-кадгерин, в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников 79
3.6. Исследование экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов in vitro 81
3.6.1. Иммуноцитохимический анализ экспрессии медленной и быстрых изоформ ТЦМ 81
3.6.2. Анализ экспрессии эмбриональной изоформы ТЦМ 87
3.6.3. Экспрессия перинатальной изоформы ТЦМ : 89
3.8.3. Анализ экспрессии изоформы р ТЦМ 91
3.8.4. Исследование экспрессии гена, кодирующего ТЦМ 2а 93
Глава 4. Обсуждение результатов 95
4.1. Сравнительная характеристика культур миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза 95
4.1.1. Адгезивные свойства миогенных клеток-предшественников 95
4.1.1. Экспрессия генов маркеров миогенных клеток-предшественников 99
4.2. Влияние Са~ на дифференцировку сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro 103
4.3. Темпы дифференцировки сателлитных клеток и миобластов, вьщеленных из скелетных мышц крыс
на разных стадиях онтогенеза 106
4.5. Особенности экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки миогенных клеток-предшественников in vitro 107
Выводы 112
Список литературы 114
