Введение
1. Введение 6
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Цели и задачи 8
1.3. Основные положения, выносимые на защиту 9
1.4. Научная новизна 9
1.5. Теоретическое и практическое значение работы 10
1.6. Финансовая поддержка 10
1.7. Апробация диссертации 10
1.8. Публикации ...11
1.9. Объем и структура диссертации 11
2. Обзор литературы 12
2.1. Нуклеосомная организация хроматина 12
2.2. АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы 15
2.3. Посттрансляционные модификации гистоновых молекул, связанные с процессом транскрипции 23
2.4. Стадия элонгации транскрипции, факторы элонгации 28
2.5. Организация хроматина кодирующих областей дерепрессированных генов 35
2.6. Заключение 40
3. Материалы и методы 41
3.1. Фрагментация ДНК в составе ядер ДНКазой I, ДНКазой II и микрококковой нуклеазой (МНазой) 41
3.1.1. Выделение клеточных ядер 41
3.1.2. Обработка ядерных суспензий МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II..41
3.1.3. Фракционирование фрагментов хроматина после
МНазной фрагментации ДНК в составе ядер 42
3.1.4. Выделение ДНК и электрофоретический анализ длины фрагментов 42
3.1.5. SDS электрофорез белков фракций хроматина печени крыс в 18%ПААГ ...43
3.2. Получение и анализ фрагментов кодирующей области генов tat и to 43
3.2.1. Получение плазмидной ДНК из клеток E.coli,
трансформированных рекомбинантными плазмидами 43
3.2.1.1. Выделение плазмидной ДНК путем щелочного лизиса и очистки в градиенте плотности CsCl 43
3.2.1.2. Выделение плазмидной ДНК методом минипреп 43
3.2.2. Получение ДНК-зондов — фрагментов кодирующей области to и tat генов препаративным электрофореом в 6% ПААГ 44
3.2.3. Перенос фрагментов ДНК с геля на нитроцеллюлозную мембрану 44
3.2.4. Гибридизация фрагментов ядерной ДНК с сегментами кодирующих областей tat и to генов 45
3.2.5. Определение 5- иЗ- границ фрагментов МНазного переваривания to гена в ядрах клеток печени крыс 45
3.2.6. Дот-гибридизация ДНК из фракций хроматина печени крыс с сегментом кодирующей области гена to 45
4. Результаты 47
4.1. Получение ДНК-зондов - сегментов кодирующих областей генов tat и to.Al 4. 2. Анализ нуклеазной фрагментации ДНК кодирующих областей to и tat генов в ядрах печени и мозга взрослых крыс 51
4.2.1. Фрагментация ДНК кодирующей области to и tat генов микрококковой нуклеазой в составе ядер клеток печени и мозга крыс 52
4.2.2. Фрагментация ДНК кодирующей области to и tat генов ДНКазой I и ДНКазой II в составе ядер печени и мозга крыс 62
4.2.3. Фрагментация ДНК кодирующей области гена to микрококковой нуклеазой и ДНКазой І в ядрах клеток печени и мозга новорожденных крыс 70
4.3. Условия селективной экстракции фрагментов активных генов после МНазной фрагментации хроматина .74
5. Обсуждение результатов 80
6. Выводы 85
7. Список литературы 86
