Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Общая характеристика основных методов генетической трансформации растений 12
1.1.1 Методы прямого переноса ДНК в клетки растений 14
1.1.2 Методы непрямого переноса ДНК в клетки растений 17
1.2 Аргобактериальная трансформация растений 18
1.2.1 Общая характеристика процесса агробактериальной трансформации растений 18
1.2.2 Функциональная организация Ті-плазмид 19
1.2.3 Процесс агробактериальной трансформации 21
1.2.4 Векторы для агробактериальной трансформации растений 25
1.2.5 Агробактериальная трансформация in vitro 26
1.2.6 Агробактериальная трансформация in planta 27
1.2.7 Факторы, влияющие на эффективность аргобактериальной трансформации 30
1.3 Практическое и фундаментальное значение генетической трансформации растений 36
1.4 Проблемы генетической трансформации растений 36
Глава 2. Материалы и методы 38
2. 1 Материалы 38
2.1.1 Использованные штаммы A. tumefaciens 38
2.1.2 Среды 40
2.1.2.1 Среды для культивирования A. tumefaciens 40
2.1.2.2 Среда для проращивания пыльцы 40
2.1.2.3 Инокуляционные среды 40
2.1.2.4 Среды для выращивания растений 41
2.1.3 Растения 41
2. 2 Методы 41
2.2.1 Агробактериальная трансформация растений 41
2.2.1.1 Приготовление суспензии бактериальных клеток 41
2.2.1.2 Обработка растений агробактериальной суспензией 42
2.2.1.3 Отбор трансформантов 43
2.2.1.4 Выделение тотальной ДНК растений 43
2.2.1.5 Выделение тотальной ДНК агробактерий 44
2.2.1.6 ПЦР-анализ 44
2.2.1.7 Электрофорез 46
2.2.1.8 Обработка данных 47
2.2.2 Определение плоидности у растений кукурузы 48
2.2.3 Выявление присутствия агробактериальной ДНК в растительном материале 48
2.2.4 Определение активности р-глюкуронидазы в листьях проростков кукурузы после трансформации 49
2.2.5 Определение экспрессии гена, в корнях проростков после трансформации 49
2.2.6 Определение содержания свободного пролина в тканях кукурузы 50
2.2.7 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro 51
Глава 3. Результаты и обсуждения 53
3.1 Влияние различных факторов на частоту агробактериальной трансформации кукурузы в условиях inplanta 53
3.1.1 Частота трансформации кукурузы в условиях inplanta при различной температуре 54
3.1.2 Зависимость частоты трансформации от способа инокуляции кукурузы A tumefaciens 66
3.1.2.1 Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при различных способах нанесения суспензии агробактерий 66
3.1.2.2 Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при разных вариантах нанесения пыльцы и суспензии A. tumefaciens на пестичные нити кукурузы 69
3.1.3 Анализ растительного материала на наличие агробактериальной ДНК 74
3.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы 75
3.2.1 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro 75
3.2.1.1 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro штаммом A. tumefaciens LBA4404, несущим векторную конструкцию с генами nptll и gus-intron 78
3.2.1.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro штаммом A. tumefaciens AGL0, несущим векторную конструкцию с генами nptllKgfp 79
3.2.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы в условиях inplanta 81
3.3 Трансформация женского гаметофита кукурузы в условиях inplanta 82
3.4 Определение экспрессии генов, перенесенных в составе Т-ДНК, в растениях кукурузы 85
3.4.1 Экспрессия гена nptll у растений кукурузы 85
3.4.2 Экспрессия гена gus-intron в листьях кукурузы 87
3.4.3 Экспрессия гена gfp в корнях кукурузы 88
3.4.4 Определение концентрации пролина у трансгенных растений кукурузы, несущих антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы 89
3.5 Анализ наследования встроек Т-ДНК у кукурузы 92
Заключение 94
Выводы 97
Благодарности 98
Список использованной литературы 99
