Введение
ГЛАВА 1. Белок-белковые комплексы в биолюминесцентных системах кишечнополостных 10
1.1. Основные характеристики белок-белковых взаимодействий 10
1.1.1. Структура и свойства белок-белковых контактов 10
1.1.2. Силы, определяющие белок-белковое взаимодействие 12
1.1.3. Распределение свойств области белок-белкового контакта 16
1.2. Метод ЯМР в определении пространственных структур белок-белковых комплексов 19
1.2.1. Гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия (HSQC) 20
1.2.2. Кросс-релаксация NOESY 22
1.2.3. Остаточное взаимодействие диполей 24
1.3. Метод молекулярного докинга в расчете пространственных структур комплексов биологических макромолекул 25
1.3.1. Общие закономерности докинга биологических макромолекул 25
1.3.2. Проблема белок-белкового докинга 29
1.4. Белок-белковые комплексы в биолюминесцентных системах кишеч нополостных 35
1.4.1. Фотопротеиновые системы 35
1.4.2. Белки системы Renilla 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Молекулярная биология 44
2.2. Экспрессия и очистка белка 44
2.2.1. Выделение и очистка люциферазы из Renilla muelleri 44
2.2.2. Получение целентеразин-связывающего белка (СВР) из Renilla muelleri 46
2.2.3. Выделение и очистка фотопротеина клитина из Clytia gregaria 48
2.2.4. Выделение и очистка зеленого флуоресцентного белка (GFP) из Clytia gregaria 48
2.3. Спектральные измерения, определение биолюминесцентной активности и концентрации белка 49
2.4. ЯМР 51
2.4.1. Получение клитина и зеленого флуоресцентного белка (GFP), меченных изотопами 13С, l5N и 2Н 51
2.4.2. Спектроскопия ЯМР 52
2.4.3. Титрование и определение величины возмущения химического сдвига 52
2.5. Расчет пространственной структуры комплекса клитин-GFP 53
2.5.1. Определение условий сближения и стыковки белков в комплексе 53
2.5.2. Метод последовательных приближений 53
2.5.3. Оценка результатов расчета пространственных структур 54
2.6. Кристаллография 55
2.7. Программное обеспечение 55
2.8. Реактивы 56
ГЛАВА 3. Белок-белковые взаимодействия между люциферазой и целен теразин-связывающим белком из Renilla muelleri 57
3.1. Характеристика целентеразин-связывающего белка (СВР) 57
3.1.1. Спектры полгощения СВР 57
3.1.2. Флуоресценция СВР 58
3.2. Биолюминесценция люциферазы с целентеразином и целентеразин-связывающим белком (СВР) 60
3.3. Расчет пространственной структуры комплекса люцифераза-СВР 65
3.3.1. Пространственная структура комплекса люцифераза-СВР 65
3.3.2. Пространственная структура комплекса люцифераза-СВР-Са~+ 67
ГЛАВА 4. Образование белок-белкового комплекса межу клитином и зеленым флуоресцентным белком (GFP) из Clytia gregaria 71
4.1. Характеристика взаимодействия в системе клитин-GFP 71
4.1.1. Спектральные свойства клитина и GFP 71
4.1.2. Биолюминесценция клитина в присутствии GFP 73
4.1.3. Регистрация белок-белкового взаимодействия в системе кли-тин-GFP при помощи разных методов 76
4.2. Пространственная кристаллическая структура клитина из Clytia gregaria со связанным целентеразином 79
4.2.1. Кристаллизация 79
4.2.2. Общая структурная организация клитина 81
4.3. Пространственная кристаллическая структура зеленого флуоресцентного белка (GFP) из Clytia gregaria 84
4.4. Исследование Са2+-регулируемого фотопротеина клитина методом гетероядерного ЯМР 87
4.4.1. Отнесение резонансов в !H-15N HSQC спектре клитина 88
4.4.2. H-^NHSQC спектр Са2+-разряженного клитина, связанного с Са2+ 90
4.4.3. Определение методом ЯМР-титрования аминокислотных остатков клитина, «затронутых» взаимодействием с GFP 92
4.4.4. Поверхность взаимодействия клитина 97
4.5. Исследование GFP методом гетероядерного ЯМР 98
4.5.1. Отнесение резонансов в H-15N HSQC спектре GFP 9Е
4.5.2. Определение методом ЯМР-титрования аминокислотных остатков GFP, «затронутых» взаимодействием с клитином 102
4.5.3. Поверхность взаимодействия GFP 105
4.6. Пространственная структура комплекса клитин-GFP 109
4.7. Экспериментальное подтверждение структуры комплекса методом сайт-направленного мутагенеза 119
Заключение 122
Выводы 124
Литература 126
