Введение
Глава 1. Материалы и методы 20
1.1. Объекты исследования 20
1.2. Биохимические методы анализа обменных процессов
1.2.1. Анализ активности ферментов углеводного и энергетического обмена в стадиях внутриклеточного развития P. grylli 21
1.2.2. Тестирование активности ферментов катаболизма трегалозы в спорах P. grylli
1.2.3. Пируват-метаболизирующая активность в спорах микроспоридий 25
1.2.4. Определение содержания запасных веществ и субстратов энергетического обмена в жировом теле сверчков, а также клетках и спорах микроспоридий 26
1.3. Молекулярно-биологические методы, использованные для поиска АТФ/АДФ- переносчиков микроспоридии P. grylli 28
1.3.1. Выделение геномной ДНК из спор микроспоридий 28
1.3.2. Саузерн-гибридизация геномной ДНК с радиоактивно мечеными фрагментами генов 28
1.3.3. ПЦР-амплификация фрагментов генов с помощью выродженных праймеров 29
1.3.4. Выделение полноразмерной копии гена 29
1.4. Методы гетерологичной экспрессии генов микроспоридии P. locustae 30
1.4.1. Компьютерный анализ генов 30
1.4.2. ПЦР-амплификация генов микроспоридии P. locustae 31
1.4.3. Создание генетических конструкций для экспрессии генов микроспоридий в бактериях E. coli 1.4.4. Гетерологичная экспрессия генов P. locustae в клетках E. сoli и очистка рекомбинантных белков 32
1.4.5. Гетерологичная экспрессия белков микроспоридий в клетках метилотрофных дрожжей Pichia pastoris 33
1.5. Иммунохимические и иммуноцитохимические методы анализа белков микроспоридий 34
1.5.1. Получение и очистка антител к рекомбинантным белкам 34
1.5.2. ДСН-ПААГЭ и иммуноблотинг 35
1.5.3. Иммунофлюоресцентная микроскопия 36
1.5.4. Иммуноэлектронная микроскопия криосрезов 37
1.6. Методы ультраструктурного и биохимического анализа секреторного аппарата микроспоридий 38
1.6.1. Приготовление образцов и электронная микроскопия 38
1.6.2. Электронная томография 40
1.6.3. Методы анализа особенностей гликозилирования белков микроспоридий 42
1.7. Анализ экспрессии генов в клетках микроспоридий 44
Глава 2. Особенности энергетического обмена микроспоридий при внутриклеточном развитии 47
2.1. Состояние проблемы к началу исследований 47
2.1.1 Зависимость микроспоридий от метаболической системы хозяина 47
2.1.2. Влияние микроспоридий на биохимические процессы в организме насекомого-хозяина 48
2.1.3. Воздействие микроспоридий на зараженную клетку 51
2.2. Биохимический анализ особенностей взаимодействия микроспоридий с энергетической системой зараженной клетки хозяина 54
2.2.1. Сравнительный анализ активности ферментов углеводного и энергетического обмена в спорах и стадиях внутриклеточного развития P. grylli 55
2.2.2. Влияние микроспоридий P. grylli на содержание запасных веществ в зараженном жировом теле сверчков 59
2.2.3. Влияние микроспоридий P. grylli на содержание субстратов и интермедиатов энергетического обмена в зараженном жировом теле сверчков 61
2.2.4. Влияние микроспоридий P. grylli на активность ферментов углеводного и энергетического обмена в жировом теле хозяина 63
2.2.5. Сопоставление биохимических данных с результатами расшифровки генома микроспоридии Encephalitozoon cuniculi 67
2.3. АТФ/АДФ-транслоказы пластидно-бактериального типа как инструмент паразитирования микроспоридий на энергетической системе хозяина 69
2.3.1. Научное значение обнаружения уникальных переносчиков в геноме E. cuniculi. 69
2.3.2. Саузерн-гибридизация геномной ДНК P. grylli с мечеными генами АТФ/АДФ-переносчиков бактерий (Chlamydia trachomatis), пластид растений (Arabidopsis thaliana) и микроспоридии E. cuniculi 72
2.3.3. ПЦР-амплификация фрагментов двух генов, кодирующих АТФ/АДФ-переносчики P. grylli с использованием вырожденных праймеров 73
2.3.4. Выделение полноразмерной копии гена ANC1 78
2.3.5. Экспрессия гена ANC1 в спорах и стадиях внутриклеточного развития P. grylli 80
2.3.6. Анализ полученных данных и сопоставление с результатами других исследований 81
2.4. Выключение метаболического аппарата клетки микроспоридий при внутриклеточном развитии
2.4.1. ПЦР-амплификация генов и создание генетических конструкций для экспрессии изучаемых белков в E. coli 85
2.4.2. Гетерологичная экспрессия белков в бактериях E. coli, выделение рекомбинантных продуктов и получение специфичных антител 87
2.4.3. Сравнительный анализ содержания метаболических ферментов и белков «домашнего хозяйства» в спорах и стадиях внутриклеточного развития P. locustae 89
2.4.4. Сопоставление полученных результатов с данными других исследований 92
Глава 3. Особенности энергетического и углеводного обмена в спорах микроспоридий 94
3.1. Состояние проблемы к началу исследований 94
3.1.1. Данные о метаболических особенностях спор микроспоридий, накопленные к середине 90-х годов прошлого столетия 94
3.1.2. Особенности энергетического обмена эндопаразитических простейших 99
3.1.3. Активность ферментов углеводного и энергетического обмена в спорах микроспоридии P. grylli 104
3.1.4. Новые направления исследования метаболического аппарата микроспоридий 108
3.2. Роль трегалозы в физиологии спор микроспоридий P. grylli 110
3.2.1. Влияние выброса полярных трубок на содержание трегалозы и глюкозы в спорах P. grylli 111
3.2.2. Влияние длительного хранения на содержание трегалозы и глюкозы в спорах P. grylli 114
3.2.3. Анализ активности трегалазы и фосфорилазы трегалозы в спорах P. grylli 114
3.2.4. Научное значение полученных данных 117
3.3. Участие митосом микроспоридий в энергетическом обмене спор 119
3.3.1. Научное значение обнаружения митосом у микроспоридий 119
3.3.2. Обнаружение митосом в спорах P. locustae 122
3.3.3. Иммунолокализация компонентов альтернативной дыхательной цепи в митосомах спор P. locustae 123
3.3.4. Связь митосом микроспоридий с мембранами спор 129
3.3.5. Научное значение полученных данных 131 3. 4. Уникальный пируват-метаболизирующий фермент 134 микроспоридий и роль пирувата в физиологии паразитов
3.4.1. Состояние проблемы на момент начала исследований 134
3.4.2. Пируват-конвертирующая активность в спорах микроспоридий 136
3.4.3. Имунолокализация ПДГ в спорах микроспоридий: эволюционная релокализация митохондриального белка в цитоплазму
спор паразита 143
3.4.4. Иммунопреципитация ПДГ P. locustae 147
3.4.5. Научное значение полученных результатов 150
Глава 4. Морфофункциональные особенности секреторного аппарата микроспоридий 154
4.1. Уникальная структура комплекса Гольджи микроспоридий: непрерывность тубулярной сети и отсутствие транспортных везикул 154
4.1.1. Состояние изученности проблемы к началу исследований 154
4.1.2. Морфологический анализ Гольджи-подобных структур P. grylli 159
4.1.3. Подтверждение отсутствия изолированных везикул в клетках микроспоридий P. grylli с использованием различных методических подходов 166
4.2. Участие Гольджи-подобных авезикулярных структур во внутриклеточном транспорте основных белков оболочки споры и полярной трубки микроспоридий 172
4.2.1. Выделение (избирательная солюбилизация) основного белка оболочки спор P. grylli 172
4.2.2. Выделение трех белков полярной трубки P. grylli 175
4.2.3. Получение поликлональных антител к белкам оболочки споры и полярной трубки P. grylli и анализ их специфичности 177
4.2.4. Внутриклеточный транспорт структурных белков полярной трубки и оболочки спор P. grylli с участием тубулярных кластеров 186
4.3. Особенности гликозилирования белков микроспоридии P. grylli, транспортируемых через комплекс Гольджи 191
4.3.1. Состояние изученности особенностей гликозилирования белков микроспоридий к началу исследования 191
4.3.2. Общая оценка степени гликозилирования белков спор P. grylli 193
4.3.3. Отсутствие N-гликозилированных белков в спорах P. grylli 195
4.3.4. Выявление остатков маннозы в структурных белках спор P. grylli 197
4.4. Экспрессия генов везикулярного транспорта в авезикулярных клетках микроспоридии P. locustae 201
4.4.1. Анализ содержания мРНК-транскрипов, кодирующих субъединицы СОРI, СОРII и SNARE-белки в клетках микроспоридий 202
4.4.2. Накопление Sec13 субъединицы COPII и SNARE-белка синтаксина в клетках микроспоридий и их связь с мембранами паразита 205
4.4.3. Предполагаемая роль генов везикулярного транспорта в авезикулярных клетках микроспоридий 208
Глава 5. Роль секретируемых белков микроспоридий в управлении физиологическими процессами и молекулярно-генетическими программами зараженной клетки насекомого-хозяина 211
5.1. Состояние изученности проблемы к началу исследований 211
5.1.1. Секретируемые белки внутриклеточных паразитов как инструмент воздействия на клетку хозяина 211
5.1.2. Косвенные данные о способности микроспоридий управлять молекулярно-генетическими программами и физиологическими процессами зараженной клетки хозяина 214
5.2. Изучение роли а/р-гидролазы P. locustae во взаимоотношениях паразита с зараженной клеткой хозяина 217
5.2.1. Анализ нуклеотидной последовательности гена а/р-гидролазы, обнаруженной в геноме P. locustae 217
5.2.2. Гетерологичная экспрессия а/р-гидролазы P. locustae в клетках бактерии Е. coli 220
5.2.3. Получение проб цитоплазмы зараженных клеток хозяина 222
5.2.4. Анализ содержания а/р-гидролазы P. locustae в клетках паразита и хозяина с помощью иммуноблотинга 224
5.2.5. Локализация а/р-гидролазы P. locustae в зараженных клетках жирового тела саранчи 226
5.3. Гексокиназа P. locustae и ее роль во взаимоотношениях паразита с зараженной клеткой хозяина 232
5.3.1. Уникальные свойства гексокиназы микроспоридий 232
5.3.2. Гетерологичная экспрессия гексокиназы P. locustae в бактериях Е. coli и получение антител к рекомбинантному белку 234
5.3.3. Иммунолокализация гексокиназы P. locustae в клетках зараженного жирового тела саранчи 236
5.4. Секретируемые LRR-белки микроспоридии P. locustae 240
5.4.1. Роль LRR-белков во взаимоотношениях между паразитом и хозяином 240
5.4.2. Гетерологичная экспрессия LRR-белков P. locustae в бактериях Е. coli и получение антител к рекомбинантным продуктам 243
5.4.3. Анализ особенностей накопления LRR-белков P. locustae в цитоплазме зараженного жирового тела саранчи 245
5.4.4. Гетерологичная экспрессия LRR-белков P. locustae в клетках метилотрофных дрожжей P. pastoris 248
5.5. Научное значение полученных данных и новые направления исследований 251
Заключение 253
Выводы 258
Список литературы
