Введение
Глава 1. Биология клетки, филогения и происхождение микроспоридий (обзор литературы) 18
1.1 Актуальные проблемы цитологии и клеточной биологии микроспоридий 18
1.1.1 Спора микроспоридий и способ заражения клетки хозяина 18
Структурные особенности и предполагаемые функции оболочки споры 19
Аппарат экструзии споры и механизм заражения клетки хозяина 23
Проникновение в клетку хозяина и особенности внутриклеточного метаболизма спор 25
Организация спороплазмы 27
Внутриклеточные стадии и их органеллы 28
Плазматическая мембрана 28
Ядро, мейоз и смена ядерных фаз 29
Митосомы 32
1.2 Эволюционные связи микроспоридий и положение в системе эукариот 33
1.2.1 История вопроса: простейшие или грибы? 33
1.2.2 Родственные связи микроспоридий внутри Opisthokonta 44
1.2.3 Родственные связи микроспоридий внутри клады ARM: ультраструктура и филогения «переходных форм» - Paramicrosporidium, Nucleophaga и Mitosporidium, а также «примитивных» микроспоридий семейств Metchnikovellidae и Chytridiopsidae 48
Глава 2. Объекты и методология исследований 58
2.1 Объекты исследований 58
2.1.1 Природные паразито-хозяинные системы 58
2.1.2 Экспериментальные паразито-хозяинные системы с участием насекомых 58
2.1.3 Клеточная экспериментальная система 61
2.2 Методы и методология морфологических исследований 64
2.2.1 Световая микроскопия 64
Визуализация живых организмов 64
Окраска микроспоридий для просмотра в светлом поле 65
Гистология и цитохимия 65
Цитохимический анализ маркеров апоптоза методом TUNEL 66
2.2.2 Флуоресцентная и конфокальная микроскопия 67
Окраска микроспоридий и ядерные красители 67
Иммунофлюоресцентный анализ 67
Флуоресцентный анализ маркеров апоптоза методом TUNEL 68
2.2.3 Трансмиссионная электронная микроскопия 69
Метод ультратонких срезов 69
Трехмерная реконструкция серийных срезов 70
Электронная томография 70
Ультраструктурная цитохимия 71
2.2.4 Специальные методические подходы ТЭМ, используемые для доказательства непрерывности секреторного пути микроспоридий и отсутствия везикул 71
2.2.5 Иммуноэлектронная микроскопия на срезах тканей, залитых в LR-White, и на криосрезах по методу Tokuyasu 73
2.2.6 Сканирующая электронная микроскопия 75
2.3 Биохимические и молекулярно-биологические методы 75
2.3.1 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГЭ) и иммуноблотинг 75
2.3.2 Флуориметрический анализ активности каспазы-3 76
2.3.3 Выделение ДНК и ПЦР-амплификация 76
Выделение геномной ДНК из очищенных спор микроспоридий и из зараженных тканей 77
Выделение ДНК из стула для ПЦР-диагностики и идентификация видов и генотипов микроспоридий человека 80
2.3.3 Лазерная микродиссекция и выделение ДНК из индивидуальных спор, вырезанных из мазков зараженных тканей 82
2.3.4 Оценка экспрессии апоптозных генов с помощью количественного ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции в 96-луночных планшетах (RT-qPCR microarray) 86
2.4 Методы филогенетического анализа и статистической обработки 87
Глава 3. Цитология, жизненные циклы и филогения микроспоридий, паразитирующих в различных систематических и экологических группах хозяев 89
3.1 Ультраструктура “низших” микроспоридий-мечниковеллид (Rudimicro sporea, Metchnikovellidae) на примере двух видов рода Metchnikovella и особенности строения «низших» микроспоридий 89
3.1.1 Ультраструктура стадий жизненного цикла Metchnikovella incurvata Caullery and Mesnil 1914, гиперпаразита грегарин Polyrhabdina sp., кишечного эндобионта полихет Pigospio elegans 89
3.1.2. Жизненный цикл и ультраструктура Metchnikovella spiralis 90
3.1.3 Эволюция аппарата экструзии: сходство ультраструктуры спор мечниковеллид и Paramicrosporidium. Морфология мечниковеллид в свете геномных данных: предковые формы или боковая ветвь? 91
3.2 Микроспоридии морских и пресноводных ракообразных 100
3.2.1 Agmasoma penaei и Perezia nelsoni – два паразита креветок семейства Penaeidae, древней группы морских Decapoda (класс Malacostraca) 100
3.2.2 Apotaspora heleios из пресноводной креветки Palaemonetes paludosus (Decapoda: Caridea: Palaemonidae) 103
3.2.3 Микроспоридии пресноводных ракообразных отрядов Cladocera (класс Branchiopoda) и Cyclopoidea (класс Maxillopoda) и молекулярная филогения «Aquatic Outgroup» 110
3.3 Ультраструктура, особенности внутриклеточного развития и филогенетические связи микроспоридий наземных насекомых 114
3.3.1 Микроспоридии рода Paranosema из клеток жирового тела прямокрылых и жесткокрылых насекомых 115
3.3.2 Микроспоридии рода Liebermannia – специализированные паразиты эпителиев кишечного тракта и его придатков 116
3.3.3 Филогенетическое положение Nosema disstriae и диверсификация близкородственных видов в группе Nosema bombycis 122
3.3.4 Сложный жизненный цикл микроспоридии Kneallhazia solenopsae, адаптированный к паразитизму в колонии общественных насекомых 131
3.4 Микроспоридии – паразиты позвоночных животных и человека 144
3.4.1 Микроспоридии рептилий: Encephalitozoon pogonae – новый вид микроспоридий из бородатой агамы Pogona vitticeps. Диверсификация рода Encephalitozoon по позвоночным хозяевам 144
3.4.2 Микроспоридии – реальные и потенциальные патогены человека 148
3.5. Заключение по главе 3 155
Глава 4. Аппарат Гольджи и секреторный транспорт микроспоридий 164
4.1 Особенности структурно-функциональной организации аппарата Гольджи (АГ) микроспоридий по сравнению с другими эукариотами 158
4.2 Ультраструктурная организация тубулярных сетей (ТС) – аппарата Гольджи микроспоридий и модификации ТС в ходе жизненного цикла 160
4.3 Морфофункциональные доказательства функций Гольджи у ТС 166
4.3.1 В ТС концентрируются секреторные белки 166
4.3.2 ТС содержат специфические маркеры АГ и, следовательно, обладают его цитохимическими функциями 169
Маркеры цис- и транс- Гольджи эукариот идентифицируют соответствующие зоны ТС микроспоридий 169
Белки полярной трубки и клеточной стенки гликозилируются в ТС 171
В ТС микроспоридий присутствуют резидентные белки АГ 171
4.4 Опыты, подтверждающие отсутствие везикул в АГ микроспоридий 173
4.5 Уроки геномных проектов 174
4.6 Микроспоридии как естественные экспериментальные системы для изучения секреторного транспорта 177
4.6.1 Многообразие моделей структурно-функциональной организации АГ и паразитические протисты в качестве модельных объектов для изучения секреторного транспорта 177
4.6.2 Уникальные и универсальные черты «минимальной» секреторной системы микроспоридий (вместо заключения) 183
Глава 5. Модуляция апоптоза клетки хозяина как механизмов патогенеза микроспоридий 187
5.1 Роль макрофагов в клеточном и гуморальном иммунитете; взаимоотношение микроспоридий с макрофагами; выбор изучаемых видов и задачи работы 188
5.2 Заражение микроспоридиями подавляет активность каспазы-3 (К-3) и ведет к уменьшению количества апоптозных ядер, окрашенных по методу TUNEL 190
5.3 Анализ экспрессии генов, связанных с апоптозом 193
5.4 Обсуждение результатов: сравнительный анализ модуляции индуцированного апоптоза микроспоридиям 198
5.5 Заключение по главе 5 и перспективы исследований модуляции клеточных циклов клеток хозяина микроспоридиями 203
Заключение 206
Выводы 209
Список литературы 212
Список использованных сокращений 258
Благодарности и источники финансирования 259
Приложения 260
