Введение
ГЛАВА 1. Целлюлозосоодержащие материалы (ЦСМ) 9
1.1. Виды и запасы ЦСМ 9
1.2. Состав и структура ЦСМ 10
1.3. Предварительная обработка ЦСМ 13
ГЛАВА 2. Ферментативное разрушение целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ) 15
2.1. Современные представления о классификации карбогидраз 15
2.2. Основные ферменты целлюлазного комплекса 15
2.3. Современные представления о механизме действия целлюлазного комплекса 18
2.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы.. 20
2.5. Штамм Penicillium verruculosum и секретируемые им ферменты 22
ГЛАВА 3. Основные подходы для увеличения продуктивности штаммов микроорганизмов 24
3.1. Влияние условий ферментации на эффективность биосинтеза ферментов грибными продуцентами 24
3.2. Получение генетически измененных штаммов P. Verruculosum
3.2.1. Ненаправленный мутагенез 27
3.2.2. Генетическая инженерия 27
Глава 4. Использование карбогидраз в различных биотехноло гических процессах 33
4.1. Использование ферментов в качестве кормовых добавок 33
4.2. Использование ферментов для отбеливания целлюлознобумажной пульпы 33
4.3. Применение ферментов в текстильной промышленности 34
4.3.1. Биоотварка хлопчатобумажных тканей 34
4.3.2 Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий 35
4.4. Применение ферментов в производстве альтернативного топлива 36
Экспериментальная часть 38
Глава 5. Объекты исследования и методы экспериментов 38
5.1. Исходный штамм-продуцент 38
5.2. Использованные вещества 38
5.2.1. Ферментные препараты 38
5.2.2. Субстраты и реактивы 38
5.2.3. Состав питательных сред 39
5.3. Методы 40
5.3.1. Мутагенез и селекция штаммов 40
5.3.2. Метод получения протопластов 41
5.3.3. CaCh/PEG трансформационный метод 41
5.3.4. Культивирование гриба P. verruculosum в колбах 42
5.3.5. Культивирование гриба P. verruculosum в ферментерах 42
5.3.6. Метод определения Сахаров 44
5.3.7. Метод определения концентрации белка 44
5.3.8. Методы определения активности ферментов 44
5.3.9. Определение гидролитической способности ферментных препаратов 44
5.3.10. Оценка "кормовой" эффективности ферментов 45
Результаты и их обсуждение 46
ГЛАВА 6. Получение рекомбинантных штаммов - продуцентов целевых ферментов 46
6.1. Получение маркерного штамма-реципиента для последующей трансформации целевыми генами р-глюкозидазы ((3Glu) и эндоглюканазы (EGII) 46
6.1.1. Получение споровой суспензии штамма гриба P. verruculosum В221-151 и подготовка к УФ - мутагенезу 46
6.1.2. Проведение УФ - мутагенеза 47
6.1.3. Отбор мутантов на селективной среде с хлоратом натрия 48
6.1.4. Скрининг устойчивых к хлорату натрия niaD мутантов среди колоний штамма Penicillium verruculosum В221-151, тестирование их по способности усваивать различные источники азота 48
6.1.5. Отбор истинных niaD мутантов 50
6.2. Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum В 537 51
6.2.1. Первичный скрининг и анализ трансформантов, содержащих
гомологичный ген эндоглюканазы II P. verruculosum 52
ГЛАВА 7. Оптимизация условий глубинного культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов р-глюкозидазы и эндоглюканазы ii в 1-литровом ферментере 56
7.1. Культивирование рекомбинантных штаммов-продуцентов ЭГП в 1-литровых ферментерах 56
7.1.1. Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма P. verruculosum ЭГИ-40 57
7.1.2. Влияние температуры и рН ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом P. verruculosum ЭГП-40 59
7.1.3. Оптимизация состава питательной среды при культивировании штамма P. verruculosum ЭГП-40 60
7.2. Культивирование рекомбинантных штаммов-продуцентов (3-глюкозид азы в 1-литровых ферментерах 61
7.2.1. Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма P. verruculosum F10 63
7.2.2. Влияние температуры и рН ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом P. verruculosum F10 66
7.2.3. Оптимизация состава питательной среды при культивировании штамма P. verruculosum F10 67
7.3. Совместное культивирование рекомбинантных штаммов P. verruculosum ЭГП-40 и F10 с исходным штаммом P. verruculosum В537 68
7.3.1. Совместное культивирование штаммов P. verruculosum В537 и F10 69
7.3.2. Совместное культивирование штамма P. verruculosum В537 и ЭГ Н-44 71
ГЛАВА 8. Индукция целлюлаз штамма P. Verruculosum ЭГП-40 различными дисахаридами 74
8.1. Получение смеси продуктов реакции поликонденсации с помощью ферментных препаратов P. verruculosum В537 и F10 74
8.2. Полная или частичная замена МКЦ на смесь Сахаров при культивировании штамма P. verruculosum ЭГП-40 в колбах 77
8.3. Исследование влияния различных дисахаридов на биосинтез целлюлаз штаммом
P. verruculosum ЭГП-40 при культивирования в колбах 79
8.4. Полная или частичная замена МКЦ на смесь Сахаров при культивировании
штамма P. verruculosum ЭГП-40 в 1 -литровых ферментерах 80
ГЛАВА 9. Культивирование трансформанта P. Verruculosum ЭГП-40 на различных целлюлозосодержащих субстратах 82
9.1. Исследование возможности полной замены МКЦ на альтернативные
целлюлозосодержащие субстраты при культивировании рекомбинантного штамма
ЭГП-40 82
ГЛАВА 10. Исследование гидролитической способности ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов p. verruculosum, по отношению к различным видам ЦСМ 87
10.1. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины 87
10.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины 93
10.3. Результаты гидролиза измельченной багассы 98
ГЛАВА 11. Исследование способности полученых ферментных препаратов к увеличению питательной ценности кормов животных и птиц 104
11.1. In vitro "кормовые" испытания препаратов ЭГП-40 и ЭГП-34 на различных типах кормов 104
Выводы 108
Список литературы
