Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Теоретические основы создания корпускулярных магнитоуправляемых сорбентов 12
1.2. Применение метода иммуномагнитной сепарации в научно-исследовательской и клинической практике 22
1.2.1. Выделение субпопуляций лимфоцитов и других видов клеток для последующего изучения их морфологии и функций в культурах in vitro
1.2.2. Иммуномагнитная селекция минорных клеточных популяций 28
1.2.3. Комбинирование иммуномагнитной сепарации с другими методами молекулярной и клеточной биологии ... 28
1.2.3.1. ИМС как дополнение иммунофлуоресцентного метода 29
1.2.3.2. Иммуномагнитная сепарация образцов для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции и другими методами молекулярной генетики 30
1.2.3.3. Новый ускоренный метод селекции и клонирования гибридом-продуцентов моноклоналъных антител с исполъзовнием иммуномагнитных сорбентов
1.2.4. Иммуномагнитные сорбенты в онкологии 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 43
2.1. Синтез магнитных полистироловых микросфер (МПМ) 43
2.1.1. Получение коллоида магнетита 43
2.1.2. Получение магнитных микросфер на основе мономеров и магнетита 43
2.1.3. Получение магнитных микросфер с поверхностными карбоксильными группами на основе мономеров, сополимера (малеинового ангидрида) и магнетита 43
2.2. Исследование физико-химических свойств магнитных полистироловых микросфер 45
2.2.1. Измерение магнитных свойств МПМ 45
2.2.2. Структурный анализ МПМ на основе мономеров и магнетита методом инфракрасной спектроскопии 46
2.2.3. Определение диаметров и характера распределения МПМ по размерам 47
2.3. Получение иммуномагнитных коньюгатов 49
2.3.1. Получение препаратов очищенных моноклональных антител (МКА) 49
2.3.1.1. Выделение иммуноглобулинов путем осаждения сульфатом аммония 49
2.3.1.2. Выделение иммуноглобулинов методом аффинной хроматографии на колонке с протеином А на сефарозе CL-4B 50
2.3.2. Активирование поверхностных гидроксильных групп МПМ/7-Ts-Cl 50
2.3.3. Конъюгирование иммуноглобулинов с МПМ 52
2.3.3.1. Получение иммуномагнитных коньюгатов путем пассивной адсорбции и с помощью ковалентного связывания после активацииp-Ts-Cl 52
2.3.3.2. Получение иммуномагнитных коньюгатов МКА с карбоксилированными магнитными микросферами 53
2.3.3.3. Количественное определение содержания МКА в растворах методом простой радиальной иммунодиффузии 53
2.3.4. Иммуномагнитная сепарация 54
2.3.4.1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови 54
2.3.4.2. Иммунофлуоресцентный анализ 55
Непрямой метод иммуноресцентного анализа 55
Прямой метод иммуноресцентного анализа 56
2.3.4.3. Иммуномагнитная селекция клеток 57
2.3.4.4. Оценка выживаемости клеток после обработки разными концентрациями химопапаина с помощью МТТ-теста 57
Проведение исследования 58
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 59
3.1. Исследование физико-химических свойств магнитных полистироловых микросфер 59
3.2. Получение иммуномагнитных конъюгатов 69
3.2.1. Оптимизация условий ковалентного связывания IgG с магнитными микросферами, активированными TsCl 70
3.2.2. Получение иммуномагнитных конъюгатов, различающихся механизмом иммобилизации моноклональных антител 74
3.2.3. Создание иммуномагнитных сорбентов путем ковалентного связывания 77 МКА с магнитными микросферами, активированными p-TsCl
3.3. Иммуномагнитная сепарация гемопоэтических клеток человека 85
3.3.1. Оценка влияния сорбционной емкости иммуномагнитных конъюгатов на эффективность селекции клеток 85
3.3.1.1. Негативная селекция Т-лимфоцитов 85
3.3.1.2. Негативная селекция В-лимфоцитов 90
3.3.2. Селекция клеток с использованием иммуномагнитных конъюгатов, различающихся механизмом связывания МКА 94
3.3.3. Селекция клеток с использованием иммуномагнитных конъюгатов, полученных путем ковалентного связывания МКА с магнитными микросферами, активированнымиp-Ts-Cl.. 101
3.3.4. Ферментативное отщепление клеток позитивной фракции от частиц сорбента 111
Выводы 118
Список литературы 120
