Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Молекулярные механизмы действия гормонов 8
1.2 Физиологические эффекты цитокинина 10
1.3 Элементы трансдукции цитокининового сигнала 10
1.3.1 Цитокипин-сеязывающие белки 10
1.3.2 Участие двухкомпонентнои системы в восприятии и передаче цитокининового сигнала 14
1.3.3 Другие возможные пути трансдукции цитокининового сигнала 21
1.4 Действие цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов 23
1.5 Транскрипционная система хлоропластов 25
1.5.1 Роль сигма-подобных факторов в дифференциальной экспрессии хлоропластных генов 26
1.5.2 ДНК-связывающие белки хлоропластов 27
1.5.3 НеспецифическиеДНК-связывающие белки хлоропластов 31
2. Объект и методы исследований 34
2.1 Объект исследований 34
2.2 Синтез коньюгата цитокинина с белком 34
2.3 Получение иммунной сыворотки против зеатинрибозида 35
2.4 Выделение моноспецифических антител к зеатину 35
2.5 Синтез иммуноаффинного сорбента (АТ2-сефарозы) для выделения АТа 36
2.6 Получение антиидиотипических антител к зеатину 37
2.6.1 Иммунизация кроликов моноспецифическими антителами к зеатину 37
2.6.2 Выделение А Та^и с помощью хроматографии на A Tz сефарозе 37
2.7 Выделение хлоропластов из листьев ячменя и экстракция из них белков 38
2.8 Хроматографическая очистка зеатин-связывающего белка 38
2.8.1 Гель-фильтрация на сефадексе Г-50 39
2.8.2 Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе 39
2.8.3 Аффинная хроматография 39
2.9 Твердофазный иммуноферментный анализ 40
2.9.1. Идентификация зеатин-связывающего белка 41
2.9.2 Определение специфичности антисыворотки против зеатин-рибозида и очищенных антител к зеатину 41
2.9.3 Выявление присутствия АТа.и в антисыворотке против зеатинрибозида 42
2.10 Участие ЗСБ в цитокинин-зависимоЙ регуляции транскрипции 42
2.11. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 43
2.12. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях 43
2.13. Электроперенос и иммуноблотинг белков 44
3. Результаты экспериментов и их обсуждение 45
3.1 Изучение чувствительности к цитокинину листьев первого яруса ячменя отделенных от растений разного возраста 45
3.2 Выделение хлЗСБ из первого листа растений ячменя разного возраста 49
3.2.1 Экстракция зеатиНСвязываюгцего белка из хлоропластов.49
3.2.2 Очисткахлоропластного зеатин-связывающего белка 51
3.3 Функциональные свойства выделенного хлЗСБ 55
3.3.1 Сравнение транскрипционной активности хлЗСБ, выделенных из 3-, 10-и 14-дневных растений ячменя 57
3.4 Изучение хлЗСБ в условиях нативного электрофореза 62
3.4.1 Сравнение хлЗСБ из листьев ячменя 3-, 10-и 14-дневных растений в условиях нативного электрофореза 66
3.5 Исследование видовой специфичности цитокининсвязывающего белка 72
3.5.1 Исследование транскрипгщонной активности хлЗСБ из листьев ячменя в хлоропластном лизате из листьев риса и люпин 72
3.5.2 Выделение ЗСБ из хлоропластов риса 73
Заключение 75
Выводы 78
