Введение
ГЛАВА 2. Обзор литературы
2.1. Регуляция клеточного цикла
2.1.1. Циклин-зависимые киназы и регуляция их активности 12
2.1.1.1.Регуляция активности циклин-киназных комплексов с помощью регуляторной субъединицы циклина 12
2.1.1.2. Регуляция активности циклин-зависимых киназ путем их фосфорилирования 14
2.1.1.3. Регуляция активности циклин-зависимых киназ путем связывания с ингибиторами 15
2.2. Контрольные точки клеточного цикла
2.2.1. Роль белков ATM, ATR и их мишеней в функционировании контрольных точек 16
2.2.2. Роль р38 МАРК в функционировании контрольных точек 18
2.2.3. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в фазеві 21
2.2.4. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в фазе S 23
2.2.5. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в фазе G2 28
2.3. Фосфатазы Cdc25: структура и функции 32
2.3.1. Фосфатаза Cdc25C 34
2.3.2. Фосфатаза Cdc25B 36
2.3.3. Фосфатаза Cdc25A 36
2.3.3.1. Регуляция активности фосфатазы Cdc25A путем фосфорилирования 39
2.3.3.2. Механизм протеасомной деградации фосфатазы Cdc25A 42
2.3.3.3. Регуляция активности фосфатазы Cdc25A путем связывания с белком 14-3-За 43
2.4. Клетки линии HeLa 44
ГЛАВА 3. Материал и методика 46
3.1. Получение клеточных линий с индуцибельнои экспрессией различных форм фосфатазы Cdc25A и их культивирование 46
3.2. Плазмиды и сайт-специфический мутагенез 46
3.3. Облучение клеток, вызов осмотического шока, обработка клеток ингибиторами киназ, ингибиторами белкового синтеза и протеасомной деградации , 47
3.4. Анализ содержания белков методом иммуноблоттинга 48
3.5. Определение скорости синтеза ДНК 48
3.6. Подавление экспрессии киназы Chkl с помощью siRNAKChkl 49
3.7. Анализ функциональной активности мутантной формы фосфатазы Cdc25A in vitro , 49
3.8. Определение количества митотических клеток 50
3.9. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла 51
3.10. Анализ функциональной активности циклин-киназных комплексов in vitro 51
ГЛАВА 4. Результаты 53
4.1. Замена Ser75 на Ala отменяет деградацию Cdc25A в делящихся клетках 53
4.2. Деградация фосфатазы Cdc25A после повреждения ДНК зависит от фосфорилирования по Ser75 57
4.3. Разные киназы отвечают за деградацию Cdc25A после различных стрессовых воздействий 62
4.4. Анализ уровня фосфорилирования фосфатазы Cdc25A после различных стрессовых воздействий 65
4.5. Анализ распределения по фазам цикла клеток HeLa, экспрессирующих различные формы Cdc25A 67
4.6. Киназы р38 и Chkl участвуют в остановке синтеза ДНК после стрессовых воздействий 67
4.7. Клетки останавливают синтез ДНК после облучения, несмотря на присутствие постоянно активной Cdc25A 71
4.8. Киназы р38 и Chkl участвуют в остановке клеточного цикла на границе перехода G2—»М после стрессовых воздействий 75
4.9. Экспрессия стабильной формы Cdc25A позволяет увеличить количество клеток, преодолевших контрольную точку G2/M после стрессовых воздействий 78
4.10. Анализ активности циклин-зависимых киназ cdk2 и cdc2 в клеточных линиях, экспрессирующих различные формы фосфатазы Cdc25A 80
ГЛАВА 5. Обсуждение 84
5.1. Изучения сайтов фосфорилирования Cdc25A, участвующих в регуляции ее стабильности 85
5.2. Разные киназы фосфорилируют Cdc25A после разных стрессовых воздействий 88
5.3. Анализ осуществления клетками HeLa контрольных точек 90
Выводы 97
Список работ, опубликованных по теме диссертации 98
Список литературы 99
Благодарности 114
