Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Организация ферментов биосинтеза дНТФ 9
1.1.1. Биосинтез дНТФ в клетках E.coli, инфицированных бактериофагом Т4 9
1.1.2. дНТФ-синтезирующие комплексы (ДСК) 10
1.1.3. Связь ДСК с репликационным аппаратом 14
1.1.4. Организация ферментов биосинтеза дНТФ в других организмах 15
1.2. Особенности физиологии бактериофага Т5 17
1.2.1. Общие черты бактериофага Т5 , 17
1.2.2. Особенности структуры ДНК 17
1.2.3. FST-механизм транспорта ДНК в клетку 19
1.2.4. Регуляция транскрипции генов 19
1.2.5. Разрушение ДНК клетки-хозяина.. 20
1.2.6. Ферменты биосинтеза дНТФ 22
1.2.7. Степень изученности генома бактериофага 24
1.3. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5 25
1.3.1. Роль фермента в метаболизме ., 25
1.3.2. Описание фермента и его свойства 26
1.3.3. Пространственная структура нуклеозидмонофосфаткиназ 27
1.3.4. Структурные основы субстратной специфичности 31
2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Микробиологические методы 33
2.1.1.Штаммы бактерий, бактериофаги, плазмиды и среды 33
2.1.2. Получение бактериофага Т5 в высоком титре 33
2.1.3. Получение биомассы клеток Ксоїї, инфицированных бактериофагом Т5 34
2.2. Аналитические методы 34
2.2.1. Метод определения белка 34
2.2.2. Электрофорез белков в ПААГ 34
2.2.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот 35
2.2.4. Изоэлектрофокусирование 35
2.2.5. Определение молекулярной массы дНМФ-киназы бактериофага Т5 35
2.3. Определение активности дНМФ-киназ 35
2.3.1. ХроматографическиЙ метод 35
2.3.2. Спектрофотометрический метод 36
2.3.3. Тестирование активности методом тонкослойной хроматографии 37
2.4. Методы очистки дНМФ-киназы бактериофага Т5 37
2.4.1.. Приготовление клеточного экстракта 37
2.4.2. Удаление нуклеиновых кислот 37
2.4.3. Фракционирование сульфатом аммония 38
2.4.4. Ионообменная хроматография 38
2.4.5. Аффинная хроматография 39
2.5. Методы молекулярной биологии 39
2.5.1. Выделение ДНК 39
2.5.2. Гидролиз ДНК 40
2.5.3. Лигирование фрагментов ДНК , 41
2.5.4. Полимеразная цепная реакция 41
2.5.5. Определение первичной последовательности ДНК , 42
2.5.6. Праймеры , 43
2.5.7. Получение компетентных клеток и их трансформация 46
2.5.8. Скрининг рекомбинантных клонов 46
2.5.9. Экспрессия рекомбинантных плазмид 47
2.5.10. Гибридизация ДНК бактериофагов с зондом 48
2.6. Компьютерные методы 49
2.6.1. Анализ нуклеотидных последовательностей 49
2.6.2. Анализ аминокислотных последовательностей 49
2.6.3. Определение потенциальной пространственной структуры белка 49
2.7. Методы биотехнологии 49
2.7.1. Иммобилизация дНМФ-киназы бактериофага Т5 49
2.7.2, Синтез дНТФ при помощи ИФП дНМФ-киназы бактериофага Т5 50
3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Выделение и очистка дНМФ-киназы бактериофага Т5 51
3.1.1. Очистка дНМФ-киназы 51
3.1.2. Физико-химические свойства белка 52
3.1.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот 56
3.2. Структурная организация фрагмента ранней области С генома бактериофага Т5 (13-19,5% генома) 56
3.2.1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности 56
3.2.2. Локализация генов и открытых рамок считывания и анализ потенциальных функций их продуктов 60
3.2.3. Потенциальные регуляторные элементы 65
3.2.4. Клонирование генаlysn его экспрессия 67
3.2.5. Идентификация продукта гена lys - лизоцима 67
3.3. Функциональная характеристика гена dnk 68
3.3.1. Клонирование гена dnk и его экспрессия ъЕхоН 68
3.3.2. Очистка рекомбинантной дНМФ-киназы и ее свойства 70
3.3.3. Анализ потенциальной структуры фермента 71
3.3.4. Ферментативный синтез дезоксирибоаденозин-а-тиотрифосфата (дАТФа8).,74
3.4.. Исследование широкоспецифичных киназ других бактериофагов 75
3.4.1. Ген 52 бактериофага (рСЗ 1: клонирование и экспрессия в Е. coli 75
3.4.2. Ген 52 кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности 76
3.4.3. Бактериофаг Т4-типа RB49 также кодирует дНМФ-киназу 78
3.4.4. Анализ строения фаговых киназ 80
Выводы 83
Список литературы 85
Приложение 98
