Введение
Глава I. Обзор литературы 12
Раздел 1. Полиморфизм тиопурин-8-метилтрансферазы (ТПМТ) 12
1.1. Метаболизм тиопуриновых препаратов в организме человека 12
1.2. Фермент ТПМТ, его основные свойства и функции в клетке 16
1.3. Генетический полиморфизм гена ТПМТ человека 17
1.3.1. Структура и функции гена ТПМТ. 17
1.3.2. Полиморфные аллели гена ТПМТ. 18
Раздел 2. Мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и наследственный РМЖ иг РЯ 23
2.1. Эпидемиология РМЖ и РЯ 23
2.1.1. Заболеваемость и смертность от РМЖ и РЯ в мире 23
2.1.2. Факторы риска развития РМЖ и РЯ 25
2.2. Наследственные синдромы предрасположенности к РМЖ и РЯ 27
2.3. Гены предрасположенности к РМЖ и РЯ 30
2.3.1. Высоко- и низкопенетрантные гены предрасположенности к РМЖиРЯ 30
2.3.2. Гены BRCA1 и BRCA2, их структура и функции их белковых продуктов 31
2.3.3. Ген СНЕК2, его структура и функции белкового продукта 41
2.4. BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 мутации 43
2.4.1. Основные типы мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 ассоциированные с риском развития РМЖ и РЯ 43
2.4.2. Спектр и частота мутаций BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 генов в различных популяциях мира 45
2.4.3. Риск развития РМЖ и РЯ для носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и CHEK2 50
2.4.4. Молекулярно-патологические особенности BRCA-ассоциированных опухолей МЖ и яичников 52
2.4.5. Основные подходы к профилактике онкозаболеваний для носителей BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 мутаций 54
Раздел 3. Молекулярно-генетические методы диагностики мутаций в генах человека 56
3.1. Основные молекулярно-генетические методы, применяемые для диагностики мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 56
3.2. ДНК-биочипы: история создания, типы, применение 57
3.2.1 История создания и основные типы ДНК-биочипов, применяемых в настоящее время 57
3.2.2. ДНК-биочипы на основе трехмерных ячеек геля и их основные приложения 62
Глава II. Материалы и методы 70
1. Клинический материал 70
2. Экстракция геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови 72
3. Изготовление биочипов 73
3.1. Синтез олигонуклеотидных проб 73
3.2. Технология производства биочипов 76
4. Проведение ПЦР 77
4.1. Синтез олигонуклеотидов-праймеров 77
4.2. Амплификация фрагментов ДНК 78
4.3. Визуализация продуктов ПЦР в агарозном геле 82
5. Гибридизация меченого продукта ПЦР на биочипе 82
6. Регистрация и анализ полученных результатов гибридизации 83
7. Секвенирование ДНК 85
8. Статистическая обработка данных 85
Глава III. Результаты и их обсуждение 86
Раздел 1. Диагностика полиморфизма гена ТПМТ . 86
1.1. Подготовка образца ДНК для анализа 86
1.1.1. Выбор метода подготовки образца ДНК 86
1.1.2. Подбор системы праймеров для проведения двухэтапной ПНР... 87
1.1.3. Выбор оптимального температурно-временного режима ПЦР ... 89
1.1.4. Оптимизация химического состава реакционной смеси ПЦР 91
1.2. Разработка ТПМТ-биочипа 94
1.2.1. Выбор полиморфных вариантов в гене ТПМТ для анализа на биочипах 94
1.2.2. Подбор дискриминирующих олигонуклеотидов для идентификации олигонуклеотидных замен в гене ТПМТ человека и разработка схемы ТМПТ-биочипа 95
1.2.3. Подбор оптимальных физико-химических параметров гибридизации на биочипе 98
1.2.4. Оценка точности и чувствительности метода 104
1.3. Генотипирование пациентов 108
Раздел 2. Диагностика наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 112
2.1. Подготовка образца ДНК для анализа 112
2.2. Разработка РМЖ-биочипа 113
2.2.1. Выбор генов и мутаций 113
2.2.2. Подбор олигонуклеотидов и разработка схемы РМЖ-биочипа. Подбор оптимальных физико-химических параметров гибридизации 114
2.2.3. Оценка точности и чувствительности метода 115
2.3. Диагностика наследственных форм РМЖ и РЯ у больных РМЖ, РЯ и ПМЗН 118
2.3.1. Анализ частоты мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у больных \ РМЖ,РЯиПМЗН 118
2.3.2. Взаимосвязь наличия мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 возраста начала заболевания 122
2.3.3. Взаимосвязь наличия мутаций в генах BRCA1I2 и СНЕК2
и семейной истории заболевания 124
Заключение 127
Выводы 129
Список использованной литературы
