Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Полимеразная цепная реакция как один из методов генодиагностики 11
1.1.1. Принцип метода 11
1.1.2. Преимущества полимеразной цепной реакции как метода диагностики инфекционных, инвазионных заболеваний животных и человека 15
1.1.3. Задачи в современной инфекционной и инвазионной патологии, которые можно решать с помощью полимеразной цепной реакции ...18
1.1.4. Практические требования к подбору условий проведения полимеразной цепной реакции 19
1.1.4.1. Основные требования к компонентам полимеразной цепной реакции 19
1.1.4.1.1. Фермент Taq-полимераза 19
1.1.4.1.2. ДНК 21
1.1.4.1.3. Олигонуклеотидные праймеры 23
1.1.4.1.4. Концентрация ионов MgiT 26
1.1.4.1.5. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ). 27
1.1.4.2. Выбор режима проведения полимеразной цепной реакции 27
1.1.5. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции 29
1.1.6. Предупреждение ложноположительных и ложноотрицательных результатов полимеразной цепной реакции 30
1.2. Современные модификации полимеразной цепной реакции 34
1.3. Альтернативные ПЦР-методы амплификации нуклеиновых кислот 37
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
2.1. Материалы и методы 40
2.1.1. Материалы ..40
2Л.1.1. Штаммы и ДНК микроорганизмов, эукариотичексие ДНК, использованные при разработке ПНР тест-систем для идентификации Toxoplasma gondii, Neospora caninum 40
2.1 Л .2. Лабораторные животные 41
2.1Л .3. Клинический и патологический материал 41
2.1 Л .4. Оборудование и химические реактивы 41
2.1.2. Методы : 45
2.1.2.1. Полимеразная цепная реакция , 45
2.1.2Л.1. Выделение хромосомной ДНК из культур клеток Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis sp.; сыворотки крови, образцов тканей глаз, головного и спинного мозга, сердца, легких, печени, селезенки, почек, мышечной ткани 45
2.1.2.1.2, Определение концентрации ДНК 46
2Л .2 Л .3. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР) 47
2 Л .2Л .4. Условия проведения полимеразной цепной реакции .47
2.1.2.1.5. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции 48
2Л.2Л.6. Предупреждение ложноположительных и ложноотрицательных результатов полимеразной цепной реакции
48
2.1.2.2. Определение чувствительности разработанных ПНР тест-систем для диагностики протозойных заболеваний животных 49
2.1.2.3. Разработка контрольных ПЦР-позитивных образцов ДНК нового типа 49
2.1.2.4. Моделирование острой токсоплазмозной инвазии на лабораторных животных 50
2.1.2.5. Проведение иммунологических методов диагностики 51
2.1.2.5.1. Иммуноферментный анализ (ИФА) 51
2.1.2.5.2. Реакция непрямой иммунофпюоресценции (РНИФ) 51
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 52
2.2.1. Генетическое типирование близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp. методом полимеразной цепной реакции с помощью универсальных праймеров .52
2.2.2. Разработка ПЦР"- тест-системы для диагностики токсоплазмоза животных 57
2.2.2.1. Подбор оптимальной методики выделения ДНК из культур клеток Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis sp ..57
2.2.2.2. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции 58
2.2.2.3. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР-анализа 59
2.2.2.4. Проверка таксономической специфичности ПЦР тест-системы для идентификации Toxoplasma gondii 68
2.2.2.5. Определение чувствительности ПЦР тест-системы для идентификации Toxoplasma gondii 71
2.2.2.6. Разработка программы постановки полимеразной цепной реакции для данной тест-системы в быстром режиме амплификации 73
2.2.3. Разработка ПЦР тест-системы для диагностики неоспороза животных 74
2.2.3.1. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции 74
2.2.3.2. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР-анализа 76
5
2.2.3.3. Проверка таксономической специфичности ПЦР тест-систем 1 и 2 для идентификации Neospora caninum 85
2.2.3.4. Определение чувствительности ПЦР тест-систем 1 и 2 для идентификации Neospora caninum 92
2.2.4. Разработка контрольных ПЦР позитивных образцов ДНК нового типа в ПЦР тест-системах "Токсоплазма ампли-тест", "Неоспора ампли- тест" ...98
2.2.5. Апробирование ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" на клиническом и патологическом материале 101
2.2.5.1. Подбор оптимальной методики выделения ДНК из сыворотки крови, образцов тканей глаз, головного и спинного мозга, сердца, легких, селезенки, почек, мышечной ткани ; 101
2.2.5.2. Выявление возбудителя токсоплазмоза методом полимеразной цепной реакции при моделировании острой инвазии на лабораторных животных 101
2.2.5.3. Выявление возбудителя токсоплазмоза методом полимеразной цепной реакции в клиническом и патологическом материале от естественно инвазированных животных 112
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 118
4. ВЫВОДЫ ..,..125
5. ПРАКТРЇЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 126
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
7. ПРИЛОЖЕНИЕ 143
