Введение
1. Введение 7
1.1. Актуальность проблемы 7
1.2. Цели и задачи исследования 9
1.3. Основные положения, выносимые на защиту 10
1.4. Научная новизна полученных результатов 10
1.5. Теоретическое и практическое значение работы 11
1.6. Апробация работы 11
2. Обзор литературы 12
2.1. Пострешшкативная репарация ДНК. Основные понятия и определения 12
2.2. Пострегатикативная репарация ДНК у дрожжей S.cerevisiae 16
2.2.1. Я/Шб-эпистатическая группа 16
2.2.2. Роль убиквитинирования в пострепликативной репарации ДНК 20
2.2.3. Srs2 и связь пострепликативной репарации ДНК с рекомбинацией 24
2.3. Пострепликативная репарация ДНК путем синтеза с обходом повреждений 26
2.3.1. Пигментная ксеродерма вариантной формы, XP-V 26
2.3.2. ДНК-полимераза л 28
2.3.2.1. Данные биохимического анализа 29
2.3.2.2. Данные структурного анализа 33
2.3.3. Другие ДНК-полимеразы, способные осуществлять синтез с обходом повреждений 35
2.3.3.1. ДНК-полимераза і 35
2.3.3.2. ДНК-полимераза к 37
2.3.3.3. ДНК-полимераза С 38
2.3.3.4. hRevl 38
2.3.4. Двухполимеразная модель синтеза с обходом повреждений 39
2.3.5. Внутриядерная локализация Роїп в клетках человека 41
2.4. Пострепликативная репарация ДНК путем генной конверсии 42
2.5. Белок hRadl8 43
2.6. Связь репликации поврежденной ДНК с контролем прохождения клеточного цикла 44
3. Материалы и методы 48
3.1. Клеточные линии 48
3.2. Пептиды 48
3.3. Клонирование 48
3.4. Трансформация бактериальных штаммов и выделение плазмидной ДНК 49
3.5. Трансфекция и отбор стабильных трансфектантов 50
3.6. Обработка клеток метилметансульфонатом, стауроспорином и вортманнином 51
3.7. Анализ пострепликативной репарации ДНК 51
3.8. Иммуноблоттинг 52
3.9. Приготовление ядерных экстрактов клеток HeLa 53
3.10. Фосфорилирование in vitro 54
З11. Фосфорилирование in vivo 55
3.12. Иммунофлуоресцентный анализ PCNA в фиксированных клетках 56
3.13. Микроскопия и анализ изображений 57
4. Результаты 58
4 1. Ингибитор протеинкиназ стауроспорин подавляет пострепликативную репарацию ДНК в клетках ХР-А 58
4.2. Исследование фосфорилирования ДНК-полимеразы в ответ на повреждение ДНК 59
4.2.1. С - концевой пептид Роїл не фосфорилируется in vitro 61
4.2.2. Poln не фосфорилируется in vivo в ответ на повреждение ДНК 64
4.3. Исследование внутриядерной локализации белка пострепликашвной репарация ДНК hRadl 8 в клетках млекопитающих и характера ее изменения в ответ на повреждение ДНК 66
4.3.1. Создание вектора, кодирующего гибридный 6eflOKGFP-hRadl8 66
4.3.2. Экспрессия и визуализация белка GFP-hRadl8 в клетках китайского хомячка (линии V79-4) 68
4.3.3. После действия ДНК-повреждающего агента ММС наблюдается накопление белка hRadl 8 и его транслокация к местам заблокированных репликативных вилок 70
4.3.4. Стауроспорин ингибирует ММС-индуцированное накопление и транслокацию hRad 18 74
4.3.5. Вортманнин ингибирует ММС-индуцированное накопление и транслокацию hRadl 8 77
4.4. Исследование фосфорилирования hRad 18 in vivo 80
Обсуждение 82
Выводы 90
