Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Регуляторные механизмы клеточного цикла 11
2.2. Митотическое деление клеток животных и растений 14
2.3. Ядрышко - основной структурный домен клеточного ядра 16
2.3.1. Ультраструктура ядрышка 16
2.3.2. Биогенез рибосом 18
2.3.3. Основные белки клеток животных и растений, участвующие в созревании рРНК 21
2.3.4.. Аргеношильные белки ядрышка 26
2.4. Ядрышко во время митоза 26
2.4.1. Распад ядрышка в профазе/прометафазе 26
2.4.2. Сборка ядрышка в конце митоза 27
2.4.3. Регуляторные механизмы реорганизации ядрышка в митозе 28
2.5. Процесс формирования активного ядрышка в конце митоза 29
2.5.1. Восстановление транскрипции рДНК в поздней анафазе/ранней телофазе 29
2.5.2. Периферический хромосомный материал (ПХМ) 31
2.5.3. Проядрышки (prenucleolar bodies, PNBs) 33
2.5.3.1. Ранние исследования 33
2.5.3.2. Состав проядрышек 33
2.5.3.3. Динамика проядрышек в конце митоза 34
2.5.4. Цитоплазматические ядрышковые дериваты, ЦЯД (nucleolus derived foci, NDF) 36
2.5.4.1. Состав ЦЯД 36
2.5.4.2 Частично-процессированная пре-рРНК в ЦЯД 37
2.5.4.3. Динамика ЦЯД и проядрышек 38
2.5.5. Модель постмитотической сборки ядрышка (нуклеологенеза) у высших эукариот 39
3. Материалы и методы 42
3.1. Объекты исследования 42
3.2. Антитела и сыворотки 42
3.2.1. Первые антитела 42
3.2.2. Вторые антитела 43
3.2.3. ДНК-конструкты 43
3.3. Иммунофлуоресцентный анализ 44
3.4. Обработка клеток 46
3.5. Синхронизация клеток животных и растений в митозе 46
3.6. Обратимое воздействие гипотонического шока 47
3.7. Обработка клеток РНКазой А 48
3.8. Окрашивание ядрышек растительных клеток нитратом серебра (модифицированный метод, Fernandez-Gomez et al., 1969) 48
3.9. Флуоресцентная РНК-РНК гибридизация in situ
3.9.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК
3.9.2. Выделение плазмидной ДНК 50
3.9.3. Мечение проб методом транскрипции in vitro 50
3.9.4. Проверка эффективности мечения проб с помощью дот-блота 50
3.9.5. Проведение флуоресцентной РНК-РНК гибридизации in situ 51
3.10. Проточная цитометрия 52
3.11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 53
3.12. Иммуноблотинг 53
3.13. Приложение к Материалам и методам 54
4. Результаты 55
4.1. Динамика и свойства ЦЯД в нормальных митотических клетках животных и растений 55
4.1.1. Закономерности образования, размер, число/клетку, расположение ЦЯД в цитоплазме 55
4.1.2. Ко-локализация ЦЯД с астральньши микротрубочками веретена деления в клетках животных 57
4.1.3. Состав индивидуальных ЦЯД: белки и частично-процессированная пре-рРНК 58
4.1.4. Влияние актиномицина Д и ДРБ на формирование ЦЯД в митотических клетках 60
4.2. Индукция преждевременной сборки ЦЯД в метафазных клетках животных и растений 62
4.2.1. Индукция образования ЦЯД в метафазных клетках млекопитающих под действием обратимого гипотонического воздействия 62
4.2.2. Индукция формирования ЦЯД в метафазных клетках млекопитающих и растений под действием ингибиторов киназы Cdkl росковитина или стауроспорина 65
4.2.3. Влияние ингибиторов киназы Cdkl на электрофоретическую подвижность белков В23/нуклеофозмина, С23/нуклеолина и фибрилларина 67
4.3. Преждевременное вхождение в анафазу клеток, обработанных росковитином. 68
5. Обсуждение 71
5.1. ЦЯД — универсальные структуры, формирующиеся в клетках животных и растений 71
5.2. Роль рРНК в образовании ЦЯД 75
53. Возможные способы преждевременной индукции ЦЯД и механизмы образования ЦЯД в митозе 76
6. Выводы 83
7. Список работ, опубликованных по теме диссертации 84
8. Список литературы 85
