Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Системная красная волчанка 13
1.2. Аутоантитела к ДНК 14
1.2.1. Обнаружение аутоантител к ДНК 14
1.2.2. Биологическая роль аутоантител к ДНК в норме и патогенезе СКВ 16
1.2.3. Получение препаратов аутоантител к ДНК 21
1.2.4. Иммунохимические свойства патологических аутоантител к ДНК 22
1.2.5. Структура патологических аутоантител к нДНК 32
1.2.6. Взаимодействие аутоантител с ДНК 34
1.3. Каталитические антитела 37
1.3.1. Открытие новых функций антител 37
1.3.2. Механизмы каталитического действия антител 39
1.3.3. Причины возникновения природных аутоантител с нуклеазной активностью 41
1.3.4. Биологическая роль природных абзимов 42
1.3.5. Получение препаратов природных каталитических антителе нуклеазной активностью 44
1.3.6. Нуклеазная активность природных каталитических антител...46
1.4. Атомно-силовая микроскопия 51
1.5. Заключение по обзору литературы 56
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 58
2.1. Оборудование и реактивы 58
2.2. Объект исследования 61
2.3. Получение сыворотки крови и осаждение антител сыворотки сульфатом аммония 61
2.4. Обессоливание антител сыворотки крови методом гель-фильтрации на акрилексе Р-6 62
2.5. Фракционирование антител сыворотки крови методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе 62
2.6. Подбор оптимального нДНК-сорбента для аффинной хроматографии антител 63
2.6.1. Ковалентная посадка нДНК эпоксиактивацией на носители и заполнение колонок 63
2.6.1 .а. ДНК-целлюлоза 63
2.6.1.6. ДНК-сефароза 64
2.6.2. Нековалентная посадка нДНК на носители и заполнение колонок 64
2.6.2.а. ДНК-целлюлоза микрокристаллическая 64
2.6.2.6. ДНК-целлюлоза волокнистая 65
2.6.3. Проведение аффинной хроматографии на приготовленных нДНК-сорбентах 65
2.7. Получение антител к нДНК аффинной хроматографией на нДНК-целлюлозе микрокристаллической 65
2.8. Электрофоретический анализ антител в полиакриламидном геле в присутствии Ds-Na 66
2.9. Изоэлектрическое фокусирование 67
2.10. Иммуноферментный анализ 67
2.10.1. Исследование влияния активных форм кислорода на взаимодействие антител с ДНК 68
2.10.2. Статистическая обработка данных 69
2.10.3. Подбор оптимального разведения коньюгата 70
2.11. Выделение плазмидной ДНКрВЯ-322 70
2.11.1. Рост бактерий и амплификация плазмиды 70
2.11.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК pBR-322 70
2.11.3. Оценка результатов 71
2.12. Гидролиз ДНК плазмиды pBR-322 антителами к ДНК 71
2.12.1. Изучение зависимости ДНК-гидролизующей активности антител отрН реакционной среды 71
2.12.2. Оценка влияния ионов двухвалентных металлов на активность антител к ДНК 71
2.12.3. Подбор оптимальных концентраций активных форм кислорода и оценка их влияния на активность антител к ДНК 72
2.12.4. Гидролиз плазмидной ДНК pBR-322 антителами к ДНК 72
2.12.5. Определение кинетических параметров реакции гидролиза плазмидной ДНК pBR-322 антителами к ДНК 73
2.12.6. Контроли 74
2.13. Электрофоретический анализ плазмидной ДНК pBR-322 в агарозном геле 74
2.14. Флуоресцентная спектроскопия 75
2.15. Атомно-силовая микроскопия 75
2.15.1. Приготовление образцов 75
2.15.2. Визуализация ДНК и антител 75
ГЛАВА 3. Результаты исследований 77
3.1. Выделение и характеристика антител к нативной ДНК из сывороток крови больных СКВ 77
3.1.1. Выделение из сывороток крови IgG, содержащих антитела к ДНК 77
3.1.2. Фракционирование антител к нативной ДНК методом аффинной хроматографии на ДНК-сорбенте 84
3.1.2а, Приготовление аффинных нДНК-сорбентов 84
3.1.26. Фракционирование антител к нДНК 87
3.2. Исследование ДНК-гидролизующей активности антител к ДНК 90
3.2.1. Изучение влияния состава инкубационной среды на ДНК-гидролизующую активность антител к нДНК 90
3.2.2. Изучение влияния активных форм кислорода на активность антител к нДНК и ДНКаз сывороток крови больных СКВ 92
3.2.3. Кинетические характеристики реакции гидролиза плазмидной ДНКрВК-322 антителами к нДНК 99
3.2.4. Изучение гидролиза плазмидной ДНК pBR-322 антителами к нДНК 103
3.3. Визуализация взаимодействия и активности антител к нДНК с ДНК методом атомно-силовой микроскопии 108
3.3.1. Подбор и оптимизация методики приготовления образцов ДНК для АСМ 108
3.3.2. Подбор и оптимизация параметров сканирования молекул ДНК и обработка полученных изображений 110
3.3.3. Исследование взаимодействия и активности антител к нДНК с ДНК 111
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 125
Выводы 145
Литература ...146
