Введение
І.Обзор литературы 12
1.1 .Терапевтический ангиогенез: основные подходы 12
1 2. Использование МСК жировой ткани для стимуляции ангиогенеза 31
1.3. Старение МСК 50
1 4.Персонализированный подход к клеточной терапии с использованием аутологичных МСК-ЖТ 62
Заключение обзора литературы 65
2.Материалы и методы 65
2.1. Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование 65
2.2.Экспериментальные животные 69
2.3.Выделение МСК из жировой ткани 69
2.4.Культивирование МСК-ЖТ 71
2.5.Моделирование гипоксии 71
2.6.Характеристика МСК-ЖТ 72
2.6.1.Анализ экспрессии маркеров МСК на поверхности клеток 72
2.6.2. Оценка способности клеток к остеогенной и адипогенной дифференцировке в индуктивных средах роста 72
2.6.3. Оценка жизнеспособности клеток 73
2.6.4. Оценка пролиферации клеток 74
2.6.5. Определение относительной длины теломер в клетках 75
2.7.Оценка продукции активных форм кислорода в МСК-ЖТ 75
2.8.Выделение РНК из клеток 75
2.9. Количественная ГЩР с обратной транскрипцией в реальном времени 76
2.9.Сравнительная оценка транскриптома МСК-ЖТ человека, культивированных в стандартных и гипоксических условиях 79
2.10. Оценка экспрессии урокиназного рецептора (uPAR) на поверхности МСК-ЖТ человека80
2.11. Анализ содержания факторов роста в кондиционированной среде с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) 80
2.12.0ценка активности металлопротеиназ 2 и 9 типов (ММГТ-2 и ММП-9) в кондиционированной среде методом зимографии 81
2.13.Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле82
2.14.Ангиогенез в подкожном имплантате Матригеля 83
2.15.Статистический анализ 85
3.Результаты 86
3.1. МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, сравнимы по морфологии, иммунофенотипу и пролиферативной активности, но различаются по накоплению маркеров старения 86
3.2.Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ человека 92
3.2.1. Образование капилляроподобных структур эндотелиалъными клетками на Матригеле в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ пациентов разного возраста 92
3.2.2. Содержание ангиогенных факторов роста в кондиционированной среде от МСК-ЖТ пациентов разного возраста 95
3.2.3. Содержание мРНКгенов факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста 100
З.З.Влияние возраста на экспрессию и активность протеаз в МСК-ЖТ 102
3.3.1. Содержание мРНКурокиназы, урокиназного рецептора, ингибитора активатора плазминогена 1 типа и металлопротеиназ 2 и 9 типов в МСК-ЖТ 102
3.3.2. Экспрессия урокиназного рецептора на мембранной поверхности МСК-ЖТ 103
3.3.3.Активность ММП-2 иММП-9 в кондиционированной среде от МСК-ЖТ. 105
3.4. Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ мышей 106
3.4.1.С возрастом пролиферация МСК-ЖТ мышей снижается, а доля апототических клеток в популяции увеличивается 106
3.4.2.С возрастом продукция активных форм кислорода в МСК-ЖТ мышей и способность клеток к остеогенной дифферещировке усиливается 108
3.4.3. Способность МСК-ЖТ мышей стимулировать ангиогенез in vitro и in vivo снижается с возрастом 110
3.4.4.При старении в МСК-ЖТ мышей изменяется профуиль экспрессии генов факторов, регулирующих ангиогенез 113
3.5.Влияние кратковременной гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ при старении.. 115
3.5.1. Гипоксия вызывает изменения профиля экспрессии генов в МСК-ЖТ человека 116
3.5.2. Гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ молодых мышей стимулировать рост кровеносных сосудов на модели подкожной имплантации Матригеля 120
3.5.3. При старении ответ МСК-ЖТ на гипоксию изменяется 125
4.Обсуждение результатов 126
Заключение 144
Выводы 147
Список литературы 149
