Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы
2.1. Окислители и антиоксиданты 10
2.2. Повреждения ДНК
2.2.1. Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК 13
2.2.2. Продукты электрофильного присоединения 13
2.2.3. Апурин-апиримидиновые сайты 14
2.2.4. Фотопродукты 15
2.2.5. Окисленные пиримидиновые основания 15
2.2.6. Окисленные пуриновые основания
2.2.6.1. 8-оксогуанин и формамидопиримидиновое производное гуанина 16
2.2.6.2. 8-оксоаденин и формамидопиримидиновое производное аденина
2.3. Биологические последствия окислительных повреждений ДНК 19
2.4. Репарация
2.4.1. Общий механизм эксцизионной репарации оснований 23
2.4.2. ДНК-гликозилазы 26
2.4.3. Каталитический механизм ДНК-гликозилаз 28
2.4.4. GO-система 31
2.4.5. Формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg или MutM) 33
2.4.6. Эндонуклеаза VIII (Nei) 37
2.4.7. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека, OGG1 ;... 38
2.4.8. АП-эндонуклеазы 41
2.4.9. Коррелированный поиск повреждений в эксцизионной репарации оснований 43
2.4.10. Белок-белковые взаимодействия в процессе эксцизионной репарации оснований 45
2.4.11. Полиморфные варианты гена OGG1 и риск возникновения онкологических заболеваний 2.4.11.1. Полиморфные варианты OGG1 49
2.4.11.2. Функциональность полиморфных вариантов OGG1 50
2.4.11.3. Эпидемиологические исследования ассоциации OGG1 с онкологическими и другими заболеваниями 52
3. Материалы и методы 55
3.1. Реактивы 55
3.2. Дезоксирибоолигонуклеотиды 55
3.3. Ферменты 57
3.4. Штаммы бактерий 57
3.5. Сайт-направленный мутагенез OGG1 57
3.6. Выделение 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека (OGG1) 58
3.7. Выделение АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) 59
3.8. Определение концентрации белка 60
3.9. Гель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов 60
3.10. Введение 32Р метки по 5 -концу дезоксирибоолигонуклеотидов 61
3.11. Стандартные условия отжига комплементарных цепей олигонуклеотидов 61
3.12. Определение концентрации активной формы OGG1 61
3.13. Влияние ионной силы и ионов Mg"+ на специфичность OGG1 и Fpg 62
3.14. Определение кинетических параметров Fpg и OGG1 62
3.15. Определение влияния OGG1 на активность АРЕХ1 64
3.16. Взаимодействие OGGl с АП-эндонуклеазами и ДНК-гликозилазами 64
3.17. Моделирование каталитической схемы OGG1 по методу Монте-Карло.. 65
3.18. Препаративный синтез ковалентного комплекса OGG1 с дуплексами, содержащими 8-oxoGua 66
3.19. Регистрация взаимодействия комплекса flHK OGGl с АРЕХ1, Apnlp и Nfo 66
3.20. Взаимодействие комплекса ДНКЮООІ сАРЕХІ на нитроцеллюлозных мембранах 67
3.21. Получение конкатемерной ДНК 67
3.22. Определение механизма вытеснения OGG1 АП-эндонуклеазой 68
3.23. Получение субстратов для экспериментов по коррелированному расщеплению 68
3.24. Коррелированное расщепление субстратов 69
3.25. Клонирование генов mtu-nei2 и mtu-fpg2 из М. tuberculosis 69
3.26. Комплементация генами mtu-nei2 и mtu-fpg2 мутантных фенотипов Е. coli 3.27. Экспрессия и выделение белка Mtu-Nei2 70
3.28. Определение активности препаратов Mtu-Nei2 72
3.29. Образование ковалентных комплексов Mtu-Nei2 с поврежденной ДНК.. 72
4. Результаты и их обсуждение 73
4.1. Влияние ионов Mg2+ и ионной силы на специфичность 8-оксогуанин ДНК-гликозилаз Е. coli и человека 73
4.1.1. Влияние ионной силы и дивалентных катионов на активность и специфичность OGG1 и Fpg 73
4.1.2. Влияние органических анионов на специфичность Fpg и OGG1 78
4.1.3. Отсутствие влияния полиаминов, краудинг-агентов и некоторых аналогов пуринов на активность и специфичность OGG1 и Fpg 82
4.1.4. Влияние условий реакции на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз: заключение 83
4.2. Взаимодействие OGG1 с АРЕХ1 и влияние этого взаимодействия на специфичность OGG1 86
4.2.1. Стимуляция активности OGG1 в присутствии АРЕХ1 87
4.2.2. Активность OGG1 в присутствии АРЕХ1 для субстратов с различным положением 8-oxoGua:Cyt 88
4.2.3. Активность OGG1 в присутствии АП-эндонуклеаз из S. cerevisiae и Е. coli 89
4.2.4. Влияние других ДНК-гликозилаз и АП-лиаз на активность OGG1 90
4.2.5. Образование тройного комплекса между OGG1, ДНК и АП-эндонуклеазами 91
4.2.6. Влияние АРЕХ1 на основные кинетические параметры OGG1 95
4.2.7. Расщепление АП-эндонуклеазой АРЕХ1 субстрата, содержащего аналог АП-сайта, в присутствии OGG1 97
4.2.8. Специфичность стимуляции OGG1 в присутствии АРЕХ1 99
4.3. Процессивность ДНК-гликозилаз и ее вклад в субстратную специфичность 104
4.3.1. Коррелированное расщепление одноцепочечных и двуцепочечных субстратов урацил-ДНК-гликозилазой Е. coli (Ung) 105
4.3.2. Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность фермента Fpg 109
4.3.3. Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность фермента OGG1 111 4.3.4. Коррелированное расщепление ферментами Fpg и OGG1 субстратов, содержащих брешь 112
4.3.5. Коррелированное расщепление ДНК мутантными формами Fpg 113
4.3.6. Процессивность при вытеснении АП-эндонуклеазой фермента OGG1 из комплекса с продуктом 114
4.3.7. Влияние процессивности на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз: заключение 115
4. Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1 117
4.4.1. Активность и субстратная специфичность мутантных форм OGG1 при расщеплении олигонуклеотидных субстратов 119
4.4.2. Активность и субстратная специфичность мутантных форм OGG1 при расщеплении высокомолекулярной ДНК 122
4.4.3. Стимуляция активности мутантных форм OGG1 АП-эндонуклеазой АРЕХ1 125
4.4.4. Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1: заключение 126
5. Клонирование и характеризация гомологов Nei и Fpg из М. tuberculosis 127
4.5.1. Комплементация мутантого фенотипа Е. coli 130
4.5.2. Выделение и характеризация рекомбинантного белка Mtu-Nei2 132
Заключение 136
Выводы 138
Список литературы
