Введение
1. Общая организация секреторного пути 12
1.1. Транслокация белка из цитозоля в эндоплазматический ретикулум (ЭР) 12
1.2. Внутриклеточная система транспорта секреторных белков 12
1.2.1. Комплексы окаймления СОРИ и COPI участвуют в транспорте белков между ЭР и аппаратом Гольджи ,.,
1.2.2. Клатриновое окаймление участвует в транспорте белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в лизосомы (вакуоль), от плазматической мембраны в аппарат Гольджи или лизосому (вакуоль) 15
1.2.3. Секретируемые белки покидают эукариотическую клетку преимущественно конститутивным образом ,fi
1.2.4. Слияние транспортных везикул с мембранами происходит при участии цитозольиыхи мембранных белков . ,7
1.3. Сортировка секреторных белков в секреторных путях 18
1.3.1. Сортировка растворимых белков 18
1.3.2. Сортировка мембранных белков, проходящих начальные этапы секреторного "У 20
1.3.2.1. Сигналы локализации белков в мембранах аппарата Гольджи 21
1.3.3. Сигналы сортировки трансмембранных белков в лизосомы 23
1.4. Модификации секреторных белков 24
1.4.1. Гликозилирование 24
1.4.1.1. N-гликозилирование 24
1.4.1.2. О-гликозилирование 26
1.4.2, Протеолитический процессинг 26
2. Контроль качества укладки белков в ЭР (ERQC) 28
2.1. Сборкам укладка белков происходит в ЭР 28
2.1.1. В дрожжах S. cerevisiae идентифицированы сборочные факторы 28
2.2. Контроль качества укладки белков в ЭР 29
2.2.1. Роль моноглюкозилированиых N-гликозидов в системе контроля качества (ERQC) 29
2.2.2. Роль кальнексина и кальретикулипа в системе контроле качества (ERQC) 30
2.3. Модель контроля качества укладки белков в ЭР млекопитающих 30
2.4. Контроль качества укладки белков отличается у дрожжей Sch. pombe, S.cerevisiae и млекопитающих
2.5. Маннозидаза I участвует в формировании сигнала для системы деградации неправильно свернутых белков »
2.6. Альтернативные модели системы контроля качества в клетках млекопитающих.. 33
2.7. ERp57 в комплексе с кальнексином/кальрети кули ном способствует правильной укладке белков ~ .
2.8. Модель контроля качества укладки белков в дрожжах S. cerevisiae - контроль качества без участия кальнексина, кальретикулипа и глюкозилтрансферазы (GT) -,
2.9. Гомолога компонентов системы укладки белков в дрожжах Н. polymorpha 36
3. Ответ клетки на накопление неправильно свернутых белков (UPR) 36
3.1. НАС J -активация механизма UPR 37
4. Деградация белков в секреторном пути 38
4.1. Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом (ERAD) 38
4.1.1. Компоненты система убиквитинилирования в клетках дрожжей 39
4.1.2. Компоненты системы ERAD в клетках дрожжей 40
4.2. Деградация белков в вакуоли 42
4.2.1. Вакуоль 42
4.2.2. Некоторые белки, проходящие путь секреции, направляются в вакуоль на деградацию 43
4.2.3. Рецептор вакуолярного сортинга VpslOp способен направлять в вакуоль
неправильно свернувшиеся белки ,~
Постановка задачи исследования 45
Материалы и методы 47
1. Штаммы микроорганизмов 47
1.1. Условия культивирования 47
1.2. Штаммы бактерий . coli , 47
1.2.1. Среды для выращивания Е. coli 47
1.3. Штаммы дрожжей 47
1.3.1. Среды для выращивания дрожжей 55
2. Генетические методы 55
2.1. Трансформация дрожжей Н. polymorpha и S. cerevisiae 55
2.2. Выделение и анализ ДНК клеток Н. polymorpha 56
2.3. Гибридизациониый анализ дрожжевой ДНК 56
3. Клонирование 57
3.1, Выделение плазмидной ДНК из Е. coli 57
3.2. Трансформация Е. coli 57
4. Методы работы с белками 58
4.1. Тестирование ферментативной активности uPA 58
4.2. Индукция экспрессии uPA в штаммах Н. polymorpha iiS. cerevisiae 60
4.3. Измерение суммарного клеточного белка (биуретовый метод) 60
4.4. Электрофорез и иммуноблоттинг 61
4.5. Анализ uPA из культуральной среды 61
4.6. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов 61
4.7. Определение количества uPA в препаратах культуральной среды или дрожжевых лизатах с использованием иммуноблоттинга
5. Получение антисыворотки против карбоксипептидазы Y (CPY) 63
6. Плазмнды 64
6.1. Место стыковки сигнальной последовательности с различными вариантами uPA 66
Результаты
