Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Основные факторы патогенности и персистенции у возбудителя холеры 16
1.1.1. Основные факторы патогенності! V. cholerae 16
1.1.2. Факторы персистенции 26
1.2. Участие различных глобальных регуляторных систем в генетическом контроле экспрессии генов патогенности и персистенции у возбудителя холеры .37
1.2.1 Регуляторная система quorum sensing 38
1.2.2. Негативная регуляция продукции факторов патогенності! 45
1.2.3. Регуляторный механизм координированного переключения генов, кодирующих факторы вирулентности и персистенции 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 50
2.1. Бактериальные штаммы 50
2.2. Питательные среды и реактивы 52
2.3. Методы 53
2.3.1. Культивирование штаммов 53
2.3.2. Определение продукции холерного токсина 53
2.3.3. Определение продукции ферментов: растворимой гемагглютинин/протеазы и фосфолипазы 55
2.3.4. Определение подвижности . 55
2.3.5. Электрофоретический анализ 55
2.3.6. Выявление присутствия полисахаридов 56
2.3.7. Иммуноблоттинг 57
2.3.8. Двумерный электрофорез и определение массы полученных пептидов 57
2.3.9. Выделение экзополисахарида 58
2.3.10. Количественное определение углеводов 59
2.3.11. Тонкослойная хроматография и высоэффективиая жидкостная хроматография 59
2.3.12. Выделение хромосомной ДНК 59
2.3.13. Электронно-микроскопический анализ холерных вибрионов 60
2.3.14. Блот-гибридизация 60
2.3.15. ПНР-тестирование 61
2.3.16. Определение вирулентности и холерогенности изучаемых штаммов 63
2.3.17. Секвенирование 63
ГЛАВА 3. Выявление в природных популяциях v. cholerae клонов с различной экспрессией нескольких факторов вирулентности 64
3.1. Исследование популяционного состава природных штаммов V. cholerae классического биовара 64
3.2. Культуральные и биохимические свойства морфологически разных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 68
3.3. Изучение генетических свойств двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 72
ГЛАВА 4. Выявление у v. cholerae классического биовара экзополисахаридного слоя и его биохимический анали 77
4.1. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение поверхности Т Тох+ Нар" МоГ и О Тох" Нар+ Mot+ клонов V. cholerae Дакка 35 78
4.2. Определение углеводного состава экзополисахаридного слоя и изучение его функциональной роли у модельного штамма Дакка 35 83
ГЛАВА 5. Протеомный анализ двух изогенных вариантов к cholerae классического биовара с альтернативной экспрессией генов вирулентности и персистентности и выявление сигналов внешней среды, определяющих координированное изменение их экспрессии 89
5.1. Протеомный анализ изогенных EPS" Тох+ Нар" МоГ и EPS+ Тох" Нар+ Mot+ вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 90
5.2. Выявление сигналов внешней среды, вызывающих координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистентности 97
5.3. Популяционная изменчивость изогенных вариантов штамма Дакка 35 в условиях in vitro и in vivo 106
Заключение 110
Выводы 120
Список используемых источников 122
