Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 22
1.1. Оксилипины как биологически активные соединения 22
1.2. Метаболизм оксилипинов 27
1.3. Общая характеристика липоксигеназ 30
1.4. Специфичность действия липоксигеназ 32
1.5. Модели специфичности действия липоксигеназ 39
1.6. Третичная структура липоксигеназ 43
1.7. Липоксигеназа-3 кукурузы (ZmLOX3) 48
1.8. Общая характеристика ферментов Р450 49
1.9. Общая характеристика ферментов семейства CYP74
1.10. Структурная организация ферментов семейства СYP74 55
1.11. Алленоксидсинтазы 59
1.12. Гидропероксидлиазы 63
1.13. Дивинилэфирсинтазы 66
1.14. Эпоксиалкогольсинтазы 68
1.15. Сравнение механизмов катализа цитохромов CYP74
и монооксигеназ Р450 69
1.16. Локализация ферментов CYP74 79
1.17. Регуляция экспрессии генов ферментов липоксигеназного каскада 81
1.18. Молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада 85
1.18.1. Общие представления о молекулярной эволюции 85
1.18.2. Классификация и молекулярная филогения липоксигеназ 91
1.18.3. Классификация цитохромов семейства CYP74 95
1.18.4. Ферменты семейства CYP74 вне царства растений з
1.18.5. Молекулярная филогения ферментов CYP74 98
1.19. Постановка цели
исследования 107
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 115
2.1. Методы биоинформатики 115
2.2. Подготовка растительного материала 117
2.3. Выделение тотальной РНК из листьев растений 118
2.4. Реакция обратной транскрипции и получение двуцепочечной кДНК 118
2.5. Полимеразная цепная реакция 119
2.6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле 119
2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 120
2.8. Молекулярное клонирование ДНК
2.8.1. Характеристика бактериальных штаммов 121
2.8.2. Среды для культивирования бактерий 123
2.8.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli 123
2.8.4. Перенос плазмид в компетентные клетки Е. coli 124
2.8.5. Клонирование ПЦР-фрагментов 125
2.8.6. Клонирование полноразмерных кДНК 125
2.8.7. Клонирование целевых генов в экспрессирующие векторы 127
2.9. Сайт-направленный мутагенез клонированных генов 130
2.10. Наработка и очистка рекомбинантных белков 132
2.10.1. Выращивание культур продуцентов и индукция синтеза
рекомбинантных белков 132
2.10.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном
геле 133
2.10.3. Выделение и очистка рекомбинантных белков 134
2.11. Реактивы и материалы для исследований катализа
рекомбинантных ферментов 136
2.12. Получение препаратов из растительного материала и подготовка
субстратов 137
2.12.1. Получение препаратов ацетонового порошка семян 137
2.12.2. Получение препаратов свободных жирных кислот 137
2.12.3. Получение препаратов гидроперекисей жирных кислот 138
2.13. Кинетические исследования реакций липоксигеназного каскада 139
2.14. Анализ продуктов реакций липоксигеназного каскада методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 140
2.14.1. Хроматография на обращенной фазе 140
2.14.2. Хроматография на нормальной фазе 140
2.15. Спектральные исследования 141
2.15.1. Подготовка образцов для ГХ-МС 141
2.15.2. Проведение экспериментов по ГХ-МС 141
2.15.3. Получение спектров оптического поглощения 142
2.15.4. Получение ЯМР-спектров 142
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 143
3.1. Получение рекомбинантного фермента ZmLOX3 143
3.1.1. Экспрессия ZmLOX3 в бактериальном продуценте 143
3.1.2. Очистка рекомбинантного фермента ZmLOX3 144
3.2. Окисление линолевой и линоленовой кислот при участии ZmLOX3 и GmLOXl 148
3.3. Участие (78)-гидроперекиси 16:3 в липоксигеназном пути 151
3.4. Направленная модификация первичной структуры ZmLOX3
3.4.1. Создание мутантных форм ZmLOX3 154
3.4.2. Окисление линолевой кислоты мутантными формами ZmLOX3 156
3.4.3. Окисление сложных липидов ZmLOX3 и ZmLOX3Ala562Gly 159
3.5. Моделирование механизма ферментативного действия ZmLOX3 162
3.5.1. Трехмерная модель ZmLOX3 162
3.5.2. Модели позиционирования субстратов в активном центре липоксигеназ 164
3.6. Клонирование гена алленоксидсинтазы томата LeAOS3 171
3.7. Получение очищенного рекомбинантного фермента Le АО S3 173
3.8. Продукты превращения 9-гидроперекиси линолевой кислоты при участии LeAOS3 174
3.9. Анализ энантиомерного состава цис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты 181
3.10. Анализ энантиомерного состава а-кетола и метоксикетона 182
3.11. Превращение 13-гидроперекиси линолевой кислоты при участии LeAOS3 184
3.12. Характеристика специфичности действия LeAOS3 (CYP74C)
и алленоксидсинтазы кукурузы ZmAOS (CYP74A) 186
3.13. Превращение окиси алленаЬеАОБЗ in situ 188
3.14. Предполагаемый механизм реакции, катализируемой LeAOS3 190
3.15. Исследование доменов LeAOS3 и гидроперксидлиазы люцерны MtHPL методом сайт-направленного мутагенеза 194
3.15.1. Определение домена IHCD в первичной структуре ферментов CYP74 194
3.15.2. Выбор позиций и аминокислотных замен в полипептидной 4ennLeAOS3 199
3.15.3. Анализ продуктов катализа мутантных форм LeAOS3 201
3.15.4. Выбор сайтов и аминокислотных замен в полипептидной цепи MtHPL 207
3.15.5. Сравнительный анализ результатов сайт-направленного мутагенеза LeAOS3 и MtHPL 208
3.16. Обнаружение новых генов ферментов CYP74 льна-долгунца 214
3.17. Выявление и клонирование кДНК CYP74B16 218
3.18. Получение препарата рекомбинантного белка CYP74B16 224
3.19. Идентификация фермента СYP74B16 225
3.20. Исследование кинетических параметров реакций, катализируемых LuDES 231
3.21. Сравнение LuDES с другими членами подсемейства CYP74B 235
3.22. Направленная модификация первичной структуры LuDES 238
3.23. Каталитические свойства LuDES E292G 240
3.24. Филогенетический анализ и классификация ферментов липоксигеназного каскада
3.24.1. Филогенетический анализ липоксигеназ 250
3.24.2. Филогенетический анализ цитохромов CYP74 254
Заключение 276
Выводы 288
Список литературы
