Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Окислительный стресс 9
2.1.1. Генерация активных форм кислорода 9
2.1.2. Сенсоры АФК 16
2.1.3. Антиоксидантная защита 18
2.1.3.1. Классификация антиоксидантной системы 19
2.1.3.2. Антикислородная система защиты 23
2.1.3.3. Антирадикальная система защиты 24
2.1.3.4. Антиперекисная система защиты 35
2.1.4. Роль пероксидазы и СОД в регуляции редокс-статуса 45
2.2. Центральная вакуоль клеток растений 48
2.2.1. Вакуолярное содержимое 49
2.2.2. Вакуолярная мембрана - тонопласт 50
2.2.3. Функции центральной вакуоли 54
2.2.4. Антиоксидантная система вакуолей клеток растений 59
2.3. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования 62
3. Объект и методы исследования 65
3.1. Растительный материал 65
3.2. Выделение органелл 66
3.2.1. Метод выделения вакуолей 66
3.2.2. Выделение пластид 68
3.2.3. Выделение ядер 68
3.2.4. Выделение митохондрий 69
3.3. Оценка степени загрязнения изолированных органелл 70
3.3.1. Оценка степени загрязнения фракции вакуолей 70
3.3.2. Оценка степени загрязнения фракций пластид и митохондрий .70
3.4. Получение водных экстрактов из ткани корнеплода и выделенных органелл 71
3.5. Метод определения белка по Бредфорд 72
3.6. Определение активности супероксиддисмутазы 72
3.7. Определение активности пероксидазы 73
3.8. Электрофоретические методы определения активности ферментов 74
3.8.1. Электрофорез нативных белков 74
3.8.2. Изоэлектрофокусирование белков 75
3.8.3. Визуализация активности СОД в ПААГ 75
3.8.4. Определение активности пероксидазы в ПААГ 76
3.8.5. Определение активности каталазы в ПААГ 76
3.9. Статистическая обработка данных 76
3.10. Использованные реактивы 76
4. Результаты исследования 77
4.1. Определение чистоты фракции вакуолей 77
4.2. Исследование супероксиддисмутазы во фракциях изолированных органелл 79
4.2.1. Идентификация супероксиддисмутазы в вакуолях 79
4.2.2. Идентификация активности супероксиддисмутазы в пластидах, ядрах и митохондриях 83
4.3. Исследование во фракциях изолированных вакуолей ферментов, утилизирующих перекись водорода 85
4.3.1. Идентификация каталазы в вакуолях 85
4.3.2. Идентификация и исследование активности пероксидазы во фракциях изолированных вакуолей 86
4.3.3. Исследование способности пероксидазы окислять бетацианины вакуолей корнеплодов свеклы 90
4.4. Динамика активности и изменение изоферментного состава СОД и пероксидазы в зависимости от стадии развития растения 92
4.4.1. Активность и изоферментный состав СОД в онтогенезе растения 92
4 4.4.2. Активность и изоферментный состав пероксидазы в онтогенезе растения 94
4.5. Динамика рН клеточного сока корнеплодов в онтогенезе растения .102
4.6. Динамика активности ферментов и изменение изоферментного состава в зависимости от стрессовых условий 103
4.6.1. Активность и изоферментный состав СОД и пероксидазы при абиотическом стрессе 103
4.6.2. Активность и изоферментный состав СОД и пероксидазы при биотическом стрессе 108
5. Обсуждение 113
6. Заключение 135
7. Выводы 137
8. Список использованной литературы 138
