Введение
1. Обзор литературы 17
1.1. Общая характеристика и классификация амилоидозов .17
1.2. Молекулярно-биологические основы амилоидозов 20
1.3. Гемодиализный амилоидоз и бета2-микроглобулин .34
1.4. Структура бета2-микроглобулина и его функции в иммунной системе 38
1.4.1.Структура бета2-микроглобулина .38
1.4.2. Молекула класса I главного комплекса гистосовместимости
1.4.3. Неклассические молекулы главного комплекса гистосовместимости 42
1.5. Клинические проявления бета2-микроглобулинового амилоидоза
1.5.1. Синдром запястного канала 45
1.5.2. Амилоидная артропатия 47
1.5.3. Контрактуры сгибателей пальцев (атрофический тендосиновит) 47
1.5.4. Деструктивная спондилоартропатия .48
1.5.5. Костные кисты 48
1.5.6. Системные (висцеральные) амилоидные отложения .49
1.6. Диагностика бета2-микроглобулинового амилоидоза 50
1.7. Состав амилоидных отложений при бета2-микроглобулиновом амилоидозе .52
1.7.1. Бета2-микроглобулин – основной компонент амилоидных отложений при бета2-микроглобулиновом амилоидозе 52
1.7.2. Гликирование 53
1.7.3. Бета2-микроглобулин с усеченными аминокислотными последовательностями 54
1.7.4. Другие компоненты амилоидных отложений 55
1.8. Зелены флуоресцентные белки в качестве маркеров фибриллогенеза 58
1.9. Особенности содержания цитокинов в плазме крови больных с хронической почечной недостаточностью 62
1.10. Заключение .66
2. Материалы и методы .67
2.1. Получение 2M из ультрафильтрата больных, находящихся на
хроническом гемодиализе .67
2.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле
2.3. Окраска полиакриламидного геля Кумасси R-250 68
2.4. Идентификация выделенного белка методом MALDI-TOF 68
2.5. Получение поликлональных антител кролика к бета2-
микроглобулину человека .69
2.6. Выделение ДНК из замороженной крови .70
2.7. Полимеразная цепная реакция 71
2.8. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% полиакриламидном геле 72
2.9. Окрашивание полиакриламидного геля бромистым этидием 73
2.10. Окрашивание полиакриламидного геля нитратом серебра 73
2.11. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле 74
2.12. Выделение ДНК из агарозного геля .74
2.13. Получение компетентных клеток E. Coli .74
2.14. Лигирование 75
2.15. Трансформация компетентных клеток E. Coli .76
2.16. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. Coli .76
2.17. Секвенирование ДНК .78
2.18. Создание экспрессионной генетической конструкции pETb2m6.8 для получения рекомбинантного полноразмерного бета2-микроглобулина человека 78
2.19. Создание экспрессионных генетических конструкций pETb2m1.1, pETb2m2.1 79
2.20. Создание экспрессионной генетической конструкции pTRCb2msf
2.21. Выделение и очистка рекомбинантного полноразмерного 2M 80
2.22. Выделение и очистка белка слияния 2MSF .81
2.23. Выделение и очистка рекомбинантных 2M6 и 2M10 .82
2.24. Формирование фибрилл 2M 83
2.25. Измерение флуоресценции комплексов тиофлавина Т с фибриллами 83
2.26. Конфокальная микроскопия 84
2.27. Атомно-силовая микроскопия .84
2.28. Western-BLOT 85
2.29. Dot-BLOT 86
2.30. Иммобилизация 2M6 и 2MSF на BrCN-активированной Сефарозе 86
2.31. Исследование содержания цитокинов в плазме крови больных на хроническом гемодиализе 87
3. Результаты и обсуждение .88
3.1. Получение 2M из диализата больных на хроническом Гемодиализе .88
3.2. Получение рекомбинантного полноразмерного 2M человека .94
3.3. Получение генетических конструкций, кодирующих укороченные варианты 2M 100
3.4. Оптические свойства исходных препаратов 2M и фибриллярных форм белка 104
3.5. Получение рекомбинантного белка слияния 2MSF .113
3.6. Гуморальный иммунный ответ на фибриллы 2М .122
3.6.1. Деполимеризация «кислых» фибрилл 2М в физиологическом растворе .125
3.6.2. Обнаружение специфических антител кролика к фибриллам 2M 127
3.6.3. Перекрестное реагирование антител к фибриллам 2M с фибриллами другого происхождения .128
3.6.4. Неспецифическое связывание фибриллами 2M иммуноглобулинов класса G 129
3.7. Содержание цитокинов в плазме крови больных находящихся на хроническом гемодиализе .131
4. Выводы .149
5. Список использованной литературы
