Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1 Введение: ретинальсодержащие белки архебактерий
1.2 Структуры сенсорного родопсина 1 и сенсорного родопсина 2 13
1.3 Фотоциклы сенсорных родопсинов 16
1.4. Структура транедьюсеров сенсорных родопсинов 18
1.5 Структура и функции комплексов сенсорных родопсинов и их галобактериальных транедьюсеров 23
1.6 Представление о молекулярных механизмах передачи сигнала 27
1.7 Заключение 30
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Оборудование и материалы 31
2.1.1. Оборудование 31
2.1.2. Материалы и химические реагенты 33
2.1.3. Буферы и растворы 34
2.2. Клонирование и работа с Е.coli
2.2.1. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 37
2.2.2. Методы клонирования и работы с E.coli 39
2.3. Очистка и приготовление образцов белка 46
2.3.1. Выделение и очистка белков 46
2.3.2. Анализ качества рекомбинантных белков 49
2.3.3. Реконструкция сенсорных родопсинов 1 и 2 и совместная реконструкция сенсорного родопсина 1 и его транедьюсера в липидные мембраны 52
2.4. Спектроскопические методы 55
2.4.1. Измерение спектров поглощения в ультрафиолетовой и видимой области 55
3 Photo laxis in H.salinarum
2.4.2 Измерение времени жизни переходного состояния СРІ373 55
2.4.3 Лазерный импульсный фотолизис 56
2.4.4. Рамановская спектроскопия 57
Глава 3. Картирование региона взаимодействий между сенсорным родопсином 1 и его галобактсриальным трансдыосером 60
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка и реконструкция архебактериальных белков 61
3.1.1. Основы клонирования, экспрессии и очистки сенсорного родопсинов из H.salinarum и их трансдьюсеров 61
3.1.2. Клонирование, экспрессия и очистка сенсорного родопсина 1 64
3.1.3. Анализ рекомбинантного сенсорного родопсина 1 66
3.1.4. Клонирование, экспрессия и очистка галобактериального трансдьюсера 1 67
3.1.5. Клонирование, экспрессия и очистка делеционных мутантов галобактериального трансдьюсера 1 69
3.2. Реконструкция сенсорных родопсинов и их комплексов с галобактериальными трансдьюсерами в полярные липиды 70
3.3. Кинетика возращения основного состояния сенсорного родопсина 1 в полярных липидах пурпурных мембран H.salinarum 73
3.4. Исследование взаимодействия сенсорного родопсина 1 с укороченными трансдьюсерами, полученными из очищенных компонентов, после совместной реконструкции в полярные липиды пурпурных мембран 74
3.5. Получение химерных белков, состоящих из сенсорного родопсина 1 и его укороченных трансдьгосеров, и иследование кинетики возращения основного состояния СР1 в мембранах E.coli. 79
3.5.1. Клонирование и экспрессия химерных белков сенсорного родопсина 1 и делеционных мутантов галобактериального трансдьюсера I 81
3.5.2. Кинетика возращения основного состояния гибридных белков, состоящих из сенсорного родопсина 1 и его укороченных трансдьюсеров, в мембранах E.coli 83
3.6. Возможное объяснение механизма (не)зависимости времени распада М-состояния комплексов сенсорного родопсина 1 от рН 84
3.7. Основные результаты 88
Глава 4. Функциональная характеризация сенсорного родопсина 2 из Halobacterium salinarum, экспрессированного в E.coli 90
4.1. Клонирование, экспрессия и очистка сенсорного родопсина 2 90
4.2. Анализ рекомбинантного сенсорного родопсина 2 93
4.2.1. Анализ качества белка методами ДСН гель-электрофореза и иммуноблотинга 93
4.2.2. ESI масс-спектрометрия 94
4.3. Биофизический анализ (фотохимический анализ) 98
4.3.1. UV/Vis спектроскопия 98
4.3.2. Рамановская спектроскопия 100
4.3.3. Лазерный импульсный фотолизис 105
4.4. Основные результаты 109
Список использованной литературы 113
Благодарности 122
