Введение
Обзор литературы 6
1. Репликация кольцевых бактериальных плазмид 6
1.1 Сайты инициации репликации 7
1.2 Репликационный аппарат E.coli 11
1.3 Инициация и элонгация репликации, зависящие от плазмидных Rep белков ... 13
1.4 Репликация фага-плазмиды Р4 15
1.5 Репликация по механихму вытеснения цепи (Strand Displacement Replication)... 17
1.6 Репликация по механизму катящегося кольца 19
2. Регуляция репликации и числа копий плазмид 21
2.1 Контроль с помощью антисмысловой РНК 22
2.2 Контроль числа копий с помощью репрессора транскрипции и антисмысловой РНК 27
2.3 Регуляция с помощью итеронов 29
3. Векторы для экспрессии белков в клетках Е. coli 32
3.1 Регулируемые промоторы 33
3.2 Плазмидный репликон 35
4. Особенности генетики и механизма репликации ДНК бактериофага N15 36
Материалы и методы 43
Результаты 48
1. Механизмы регуляции числа копий профага N15 48
1.1 Идентификация промотора гена герА и изучение влияния СВ репрессора на
уровень транскрипции герА 48
1.2. Анализ роли антирепрессоров N15 в регуляции числа копий и уровня
транскрипции герА 50
1.3 Анализ взаимодействия репрессор-антирепрессор в бактериальной двугибридной
системе 51
2. Функциональная характеристика репликационного rem герА 53
2.1 Анализ аминокислотной последовательности RepA белка 53
2.2 Репликация миниплазмид, основанных на репликоне N15, в штаммах Е. coli, содержащих температурно-чувствительные мутации в генах, существенных для репликации 55
2.3 Литическое развитие фага N15 в штаммах содержащих температурно-чувствительные мутации в генах, существенных для репликации 60
2.4 Зависимость репликации фага N15 от DnaG клетки-хозяина 62
2.5 Репликация N15 не зависит от хеликазы Rep Е. coli 63
2.6 Функциональная роль потенциального DnaA-бокса в ori сайте N15 63
3. Экспрессионные вектора на основе репликона фага N15 65
3.1 Конструирование серии экспрессионных pN15E векторов 66
3.2 Конструирование штамма Е. coli DH31soplacI 68
3.3 Регуляция числа копий pN15E векторов 70
3.4 Стабильное наследование pN15E векторов в штамме DU31soplacI 71
3.5 Диапазон регуляции синтеза продукта в экспрессионных системах pN15E 72
3.6 Клонирование и экспрессия гена эндонуклеазы рестрикции Ecll8Ki 74
Обсуждение 76
1. Регуляция репликации и конроль числа копий профага N15 76
2. Функциональная характеристика герА 78
3. Роль инициаторного белка DnaA Е. соїі в регуляции репликации N15 83
4. Векторы для экспресии белков в клетках Е. соН на основе репликона N15 84
Выводы 88
Список публикаций по теме диссертации 89
Цитированная литература 90
