Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Организация генома человека и мобильные элементы 11
1.2. Строение и механизмы транспозиции мобильных элементов генома человека 12
1.2.1. Транспозоны 13
1.2.2. LTR - содержащие ретротранспозоны 13
1.2.3. LTR - иесодержащис ретротранспозоны 14
1.2.4. SINE 16
1.3. Жизненный цикл LTR несодержашего ретротранспозона L1 19
1.3.1. Транскрипция 21
1.3.2. Процессинг 21
1.3.3. Трансляция 23
1.3.4. Белок ОРТ] 24
1.3.5. Белок ОРТ2 25
1.3.6. Посттрансляционные модификации белков и образование рибонуклеопроїсинового комплекса 27
1.3.7. Доставка в ядро 28
1.3.8. Интеграция в геномную днк 29
1.4. Образование инверсий и делений элемента Ы 30
1.5. Образование укороченных копий L1 32
1.6. Перемещение элементов Ы по геномной ДНК 33
1.6,1, Гомологичная рекомбинация 33
1.6.2, Транспозиционная активность элементов L1 34
1.6.3. Частота транспозиций элементов Ы 36
1 .7. Клеточные функции элемента L1 37
1.7.1, Влияние на экспрессию генов 37
1.7.2, Восстановление двухцепочечных разрывов Д1ІК 37
1.7.3, Реорганизация генома 38
1.8. Практическое применение элементов L1 38
1.8.1. Филогенетические маркеры 38
1.8.2. Система случайного мутагенеза 39
1.8.3. Вектор для переноса генов 40
Глава 2. Экспериментальная часть 41
2.1. Материалы и реактивы 41
2.1.1. Рсактивы 41
2.1.2. Штаммы E.coli и культуры клеток 42
2.1.3. Вектора 42
2.1.4. Оли гону клеотиды 42
2.1.5. Основные буферы и растворы 43
2.1.6. Бактериальные среды 44
2.2. Методы рекомбипантных днк 44
2.3. Клонирование и экспрессия ОРТІ и фрагмента ОРТ 2 элемента Г1 lis в клетках ii.colt 45
2.4. Выделение и очитка рекомбипантных белкой из клеток \:..ай\ 46
2.5. Получение поликлональных мышиных антител 46
2.6. Клонирование и экспрессия ОРТ2 элемента Ll/V.v, кодирующей обратную транскриптазу в клетках насекомых Sf 21 47
2.6.1. Получение рекомбинантной бакмиды, несущей ОРТ2 Ll/Ул... 47
2.6.2. Получение рекомбинантного бакуловируса, несущего ОРТ2 LI//.V 48
2.6.3. Определение титра рекомбинантного бакуловируса 48
2.6.4. Наращивание и хранение рекомбинантного бакуловируса 48
2.6.5. Экспрессия ОРТ2 элемента L1//v в клетках насекомых Sf 21.. 48
2.7. Выделение рекомбинантной ОТ элемента Ы//л и:* клеток насекомых Sf2l 49
2.8. Конструирование и экспрессия элемента ЬШ.ч в клетках млекопитающих 50
2.9. Культивирование клеток эукариот 50
2.10. Выделение ядер клеток млекопитающих 51
2.1 1. Аналитические методы 51
1.1. РНК-зависимая ДНК-полимеразная реакция 51
1 .2. Получение гетерогенных матриц 51
1.3. Реакция элонгации праймера 52
1.4. Определение активности РНКазы И 52
1.5. Гель-электрофорез НК в денатурирующих условиях 53
1.6. SDS-электрофорез белков 53
1.7. Окрашивание белковых гелей нитратом серебра 53
1.8. Иммуноблотинг 53
1.9. Определение концентрации белка 54
2.12. Микроскопия 54
2.1. Световая микроскопия 54
2.2. Флюоресцентная микроскопия 54
2.12.3. Конфокальная микроскопия 54
2.12.4. Трансмиссионная электронная микроскопия 54 CLASS
CLASS Глава 3 Результаты работы и их обсуждение 56
3.1. Экспрессия гибридных белков элемента LlA/.v с целью получения пол икл о нал ьн ы х антител 56
3.2. Экспрессия белка ОРТ2 элемента Lltf.s в клетках насекомых SI2! . 58
3.3. Получение препарата обратной фанскршпазы элемента Litis 61
3.4. Оптимумы ДПК-полимеразной активности обратной транскриптазы элемента LIA/.v 63
3.5. Влияние двухвалентных катионов па активность ОТ элемента L\Hs 63
3.6. Специфичность к субстратам ОТ элемента L\Hs 66
3.7 Синтез ДНК ОТ элемента LI/7А- 67
3.8. Активность РНКазы Н ОТ элемента L1//.S 72
3.9. Локализация белка р40 элемента VAHs в клетках млекопитающих 74
3.9.1. В клетках человека линии HeLa белок р40 накапливается в цитоплазме 74
3.9.2. В клетках хомяка CHO-KI ш vivo белок р40 элемента L1//.V на капли нается в цитоплазм с 74
3. 10. Образование вирусоподобных частиц белками элемента 1/1 /7л 79
Заключение 84
Выводы 85
Литература 86
Благодарности 102
