ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ ............................................................................................................ 2
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ...................................................... 7
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 9
Актуальность темы исследования .............................................................................. 9
Степень разработанности темы ................................................................................ 12
Цель исследования ..................................................................................................... 13
Задачи, решаемые в ходе исследования .................................................................. 13
Научная новизна исследования ................................................................................ 14
Теоретическая и практическая значимость исследования .................................... 14
Методология и методы диссертационного исследования ..................................... 15
Положения, выносимые на защиту .......................................................................... 16
Степень достоверности результатов ........................................................................ 17
Апробация работы ..................................................................................................... 17
Соответствие диссертации паспорту научной специальности ............................. 17
Личный вклад автора в проведение исследования ................................................. 18
Публикации .............................................................................................................. 18
Структура и объем диссертации .............................................................................. 19
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................... 20
1.1 Репаративная регенерация костной ткани......................................................... 20
1.2 Костные морфогенетические белки для регенерации костной ткани ............ 22
1.3 Доставка генетических конструкций в клетки ................................................. 24
1.3.1 Вирусные системы доставки генов ............................................................ 25
1.3.2 Невирусные системы доставки генов ........................................................ 28
1.4 Доставка генетических конструкций в зону регенерации ............................... 40
3
1.4.1 Природные биоматериалы........................................................................... 41
1.4.2 Синтетические биоматериалы .................................................................... 44
1.4.3 Ген-активированные матриксы, содержащие плазмидные конструкции с
геном BMP2, для регенерации костной ткани ................................................... 45
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................................. 48
2.1 Получение плазмидной ДНК .............................................................................. 48
2.1.1 Трансформация E.coli плазмидной ДНК ................................................... 48
2.1.2 Получение биомассы E.coli и выделение плазмидной ДНК ................... 49
2.1.3 Рестрикция и анализ фрагментов ДНК в агарозном геле ........................ 50
2.1 Клеточные культуры ........................................................................................... 52
2.2.1 Получение и культивирование клеточных культур ................................. 52
2.2.2 Трансфекция клеток ..................................................................................... 53
2.2.3 Оценка эффективности трансфекции клеток ............................................ 54
2.2.4 Оценка жизнеспособности ММСК ЖТ по результатам МТТ-теста ....... 55
2.2.5 Оценка остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ ................................ 56
2.2.6 Сокультивирование трансфицированных и необработанных ММСК ЖТ
................................................................................................................................. 58
2.3 Исследования матриксов in vitro ........................................................................ 59
2.3.1 Матриксы ...................................................................................................... 59
2.3.2 Оценка цитотоксичности матриксов .......................................................... 61
2.3.3 Исследование адгезии клеток на поверхности матриксов методом
сканирующей электронной микроскопии ........................................................... 62
2.3.4 Оценка кинетики высвобождения полиплексов из матриксов................ 63
2.3.5 Оценка трансфицирующей способности полиплексов в составе
матриксов in vitro .................................................................................................. 63
4
2.3.6 Оценка остеоиндуктивных свойств матриксов, импрегнированных
полиплексами TF/pBMP2, in vitro........................................................................ 65
2.4. Исследования матриксов in vivo ........................................................................ 66
2.4.1 Модель внутримышечной имплантации ................................................... 67
2.4.2 Модель критического дефекта теменных костей крыс ............................ 68
2.4.3 Микрокомпьютерная томография .............................................................. 69
2.4.4 Гистологическое исследование .................................................................. 70
2.4.5 Морфометрия ................................................................................................ 71
2.5 Статистическая обработка .................................................................................. 72
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ....................................................................... 74
3.1 Определение оптимальных условий трансфекции клеточных культур ММСК
ЖТ .............................................................................................................. 74
3.1.1 Сравнение трансфицирующих агентов TurboFect, PEI и Lipofectamine
2000 для доставки плазмиды pEGFP-C1 в ММСК ЖТ ..................................... 74
3.1.2 Определение соотношения TurboFect и плазмиды pEGFP-C1 для
трансфекции ММСК ЖТ ...................................................................................... 77
3.1.3 Определение оптимальных условий трансфекции ММСК ЖТ
полиплексами TF/pEGFP ...................................................................................... 80
3.1.4 Трансфекция суспензионных культур ММСК ЖТ полиплексами
TF/pEGFP ............................................................................................................... 82
3.2 Исследование особенностей остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ после
инкубации с полиплексами с геном BMP2 .............................................................. 83
3.2.1 Сравнительная оценка индукции остеогенной дифференцировки ММСК
ЖТ различными полиплексами с геном BMP2 .................................................. 83
5
3.2.2 Индукция остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ при
сокультивировании с ММСК ЖТ, трансфицированными полиплексами с
геном BMP2 ........................................................................................................... 86
3.3 Исследование матриксов in vitro ........................................................................ 88
3.3.1 Оценка цитотоксичности матриксов на основе PLA-гранул, хитозанового
гидрогеля с разной степенью деацетилирования хитозана и PRP при
инкубации с ММСК ЖТ ....................................................................................... 89
3.3.2 Выбор условий импрегнации полиплексов в PLA-гранулы .................... 95
3.3.3 Оценка кинетики высвобождения полиплексов из матриксов PLA,
PLA/Chit и PLA/PRP ............................................................................................. 97
3.3.4 Оценка цитотоксичности матриксов PLA, PLA/Chit и PLA/PRP,
импрегнированных полиплексами TF/pBMP2 ................................................... 99
3.3.5 Исследование эффективности трансфекции ММСК ЖТ полиплексами в
составе матриксов PLA, PLA/Chit и PLA/PRP ................................................. 100
3.3.6 Исследование остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ после
инкубации с матриксами на основе PLA, PLA/Chit и PLA/PRP,
импрегнированных полиплексами TF/pBMP2 ................................................. 103
3.4 Исследование матриксов in vivo ....................................................................... 105
3.4.1 Оценка биосовместимости матриксов на основе PLA, PLA/Chit и
PLA/PRP in vivo ................................................................................................... 105
3.4.2 Оценка остеоиндуктивного действия TF/pBMP2-матриксов in vivo на
модели критического дефекта теменных костей крыс .................................... 108
3.5 Протокол получения ген-активированных матриксов ................................... 116
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................................................................... 118
ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 119
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ................................................................. 121
6
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .................................... 122
Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при
Минобрнауки России ............................................................................................... 122
Список публикаций в других изданиях ................................................................. 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................... 126
