Введение
Состав сред, используемых для культивирования микобактерий 34
Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК) 34
Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК) 35
Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием реакции обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) 35
Применение внутреннего калибровочного стандарта для
определения количества мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях 37
Подбор прайм еров для количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 37
Условия проведения реакции обратной транскрипции 38
Условия проведения ПЦР реакции 39
Характеристика количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 39
Детекция продуктов амплификации 40
Програмное обеспечение экспериментальной работы 40
Результаты и обсуждение 41
Исследование генов М. tuberculosis в качестве маркеров жизне способности и персистенции 41
Разработка количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis 42
Тестирование специфичности ПЦР и ОТ-ПЦР систем 42
Внутренние калибровочные стандарты (ВКС) 43
Определение чувствительности количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 45
Определение чувствительности количественных ПЦР систем 45
Определение чувствительности количественных ОТ-ПЦР систем 47
Многопраймерная реакция обратной транскрипции 48
Использование ВКС для количественного определения исследуе мой мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР системах 50
2.5.1. Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС) для количественных ПЦР систем
2.5.2. Определение оптимального количества внутреннего калибровоч- ^ ного стандарта (РНК-ВКС) для количественных ОТ-ПЦР систем
2 5 Определение исходного количества числа копий ДНК (мРНК) ми
шени в препарате 52
2.7. Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК 54
2.8. Выбор нормировочного маркера для сравнительного исследования количества специфических мРНК 54
Исследование генетических маркеров жизнеспособности М. Ш- 55 berculosis на моделях in vitro
3. Подбор системы ген - индуктор, позволяющей увеличить количество специфических мРНК М tuberculosis в исследуемом образце в пересчете на количество геном - эквивалента 55
4. Исследование генов dnaK, sigH \\JbpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis 58
5. Исследование гена dnaK в качестве маркера жизнеспособности как показателя действия рифампицина и изониазида на референс -штаммы М. tuberculosis 66 Исследование генетических маркеров персистенгцин М. tuberculosis на моделях in vitro
6. Использование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции М. bovis BCG в условиях моделей персистенции in vitro 73
7. Исследование динамики изменения экспрессии генов М. bovis BCG на разных стадиях персистенции на моделях in vitro
Исследование корреляции между уровнем экспрессии генов sigF, dosR, acr, Rv2623 и уровнем толерантности перс патентной культу ры М. bovis BCG к рифампиципу и метронидазолу 84
VI. Выводы 89
VII. Список литературы
