Введение
1. Введение: структура и функции клеточной стенки 10
2. Синтез глюканов клеточной стенки 13
2.1. Синтез Р-1,3-глюканов клеточной стенки 13
2.1.1. Р-1,3-глюкансинтетаза 13
2.1.2. Ген HKR1 15
2.1.3. Семейство генов, родственных GAS1 16
2.1.4. Семейство генов, родственных BGL2 18
2.2. Синтез р-1,6-глюканов 20
2.2.1. Ген KRE5 21
2.2.2. Ген BIG1 21
2.2.3. CWH41IGLS1, ROT2IGLS2 и некоторые другие гены, кодирующие белки, участвующие в синтезе N-связанных гликанов и сворачивании секретируемых белков 22
2.2.4. Гомологичные гены KRE6 и SKN1 24
2.2.5. Ген KRE11ITRS65 25
2.2.6. Ген KRE1 26
2.2.7.renbiKRE9uKNHl 26
3. Синтез хитина клеточной стенки 27
З.І.ХитинсинтетазаІ 28
3.2. Хитинсинтетаза II 28
3.3. Хитинсинтетаза Ш 28
4. Синтез -связанных гликанов секретируемых белков 29
4.1. Формирование коровой части 29
4.2. Реакции, протекающие в комплексе Гольджи: формирование «внешних цепей» или «зрелого кора» 32
5. Синтез 0-связанных гликанов секретируемых белков 35
6. Формирование гликозилфосфатидилинозитного (GPI) якоря 36
6.1. Структура GPI якоря 36
6.2. Формирование GPI якоря и его присоединение к белку 36
6.3. События, следующие за присоединением GPI якоря к белку 42
6.3.1. Деацилирование GPI 42
6.3.2. Модификация липидной составляющей GPI якоря 43
6.3.3. Добавление пятого остатка маннозы 43
6.3.4. Встраивание некоторых белков, несших GPI якорь, в КС 43
7. Сворачивание секретируемых белков 43
7.1. Связанная с ЭР деградация неправильно свернутых белков (ERAD, endoplasmic reticulum associated degradation) 44
7.2. Ответ клетки на накопление в ЭР неправильно свернутых белков (UPR,
unfolded protein response) 47
7.3. Роль ионов кальция в сворачивании секретируемых белков 49
8. Заключение, постановка задач исследования 50
Экспериментальная часть 52
1. Материалы и методы 52
1.1. Штаммы, среды, условия культивирования и стандартные генетические методы 52
1.2. Поиск мутаций, летальных в комбинации с мутацией ssu21 56
1.3. Плазмиды и генно-инженерные манипуляции 58
1.4. Флюоресцентная микроскопия 67
1.4.1. Окрашивание вакуолей в клетках дрожжей 67
1.4.2. Окрашивание ДНК клеток дрожжей с помощью DAPI 68
1.4.3 Флюоресценция химерных белков, содержащих в своем составе EGFP 68
1.4.4 Окрашивание хитина клеточных стенок дрожжей калькофлюором белым 68
1.5. Измерение активности р-галактозидазы в лизатах клеток дрожжей 69
2. Результаты исследования 70
2.1. Клонирование и секвенирование мутантной аллели ssu21 70
2.2. Гены, мутации в которых летальны или полулетальны в комбинации с мутацией ssu21 73
2.2.1. Поиск мутаций, летальных в комбинации с мутацией ssu21 73
2.2.2. Клонирование генов дикого типа, соответствующих мутантным аллелям dcsl ndcs2 77
2.2.3. Локализация белка Gwtlp 81
2.3. Чувствительность мутанта$5^2/ к кофеину 85
2.3.1. Чувствительность к кофеину у разных мутантовmcd4 85
2.3.2. Морфология вакуолей в клетках мутантаssu21 85
2.3.3. Чувствительность к кофеину мутанта ssu21 не связана с подавлением активности фосфодиэстераз, гидролизующих сАМР, и ослаблением КС... 86
2.3.4. Клонирование генов, способных в мультикопийном состоянии подавлять чувствительность мутантаssu21 к кофеину 89
2.3.5. Способность некоторых клонированных генов супрессировать другие фенотипические проявления мутации ssu21 91
2.3.6. Влияние мутации ssu21 на уровень экспрессии гена UBI4 92
3. Обсуждение результатов 94
Выводы 102
Список литературы
