Оглавление
Список использованных сокращений ................................................................... 5
ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 7
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности .................. 7
Цели и задачи исследования ............................................................................... 9
Научная новизна и практическая значимость исследования ........................ 10
Методология и методы исследования .............................................................. 10
Положения, выносимые на защиту .................................................................. 11
Степень достоверности и апробация результатов .......................................... 11
Публикации ......................................................................................................... 12
Связь работы с научными программами ......................................................... 12
Личное участие автора в проведении исследований ...................................... 12
Публикации в журналах .................................................................................... 13
Структура и объем работы ................................................................................ 14
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................... 15
1.1. Теломеры – особые участки линейных хромосом ................................... 15
1.1.1. Структура теломер, организованных теломеразой ........................... 18
1.1.2. Способы организации теломер, не имеющих теломеразы ............. 24
1.2. Принципы организации теломер Drosophila ............................................ 26
1.2.1. Теломерная ДНК ................................................................................... 26
1.2.2. Теломерные белки дрозофилы ............................................................ 29
1.2.3. Теломерная РНК и транскрипция теломер Drosophila. .................... 33
1.3. Роль РНК-интерференции в поддержании теломер ................................ 37
1.4. Регуляция транскрипции теломер в соматических тканях ..................... 39
1.5. Оогенез дрозофилы. Динамика центросом в процессе оогенеза ........... 42
1.5.1 Оогенез дрозофилы ................................................................................ 42
1.5.2. Центросомы. Образование МТОС и его динамика в оогенезе,
полярность эмбриона и нарушение функции центросом в раннем
развитии ........................................................................................................... 47
1.6. Патологии, связанные с нарушением механизмов поддержания теломер
.............................................................................................................................. 53
3
1.7. Теломерный сигналинг ............................................................................... 56
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................. 59
2.1. Объекты исследования ............................................................................... 59
2.2. Методы ......................................................................................................... 62
2.2.1. Сбор эмбрионов .................................................................................... 62
2.2.2. Гибридизация in situ с РНК-зондом .................................................... 63
2.2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ с РНК-зондом (РНК-FISH) .. 65
2.2.4. Тирамидная амплификация ................................................................. 66
2.2.5. Получение зонда для РНК FISH .......................................................... 66
2.2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ с ДНК-зондом ....................... 67
(ДНК-FISH) ...................................................................................................... 67
2.2.7. Иммуноокрашивание яичников Drosophila ....................................... 67
2.2.8. Вестерн-блот анализ ............................................................................. 71
2.2.9. Анализ полиаденилирования ............................................................... 72
2.2.10. Выделение РНК ................................................................................... 74
2.2.11. RTqPCR-анализ ................................................................................... 75
2.2.12. Статистическая обработка данных ................................................... 76
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ................................................................................................... 77
3.1. Отбор генов, влияющих на экспрессию теломерного ретротранспозона
HeT-A в яичниках D. melanogaster ................................................................... 77
3.2. Деаденилазный комплекс Ccr4-Not участвует в процессинге
транскриптов ретротранспозона HeT-A в клетках зародышевой линии. .... 82
3.2.1. Разработка метода дифференциальной пермеабилизации тканей для
проведения РНК FISH, совмещенного с иммуноокрашиванием, на
яичниках Drosophila. ...................................................................................... 86
3.2.2. Исследование деаденилазной роли Ccr4-Not комплекса в биогенезе
транскриптов теломерных ретротранспозонов ............................................ 90
3.2.3. Биогенез теломерных РНК идет в теломерных тельцах, содержащих
деаденилазный комплекс Ccr4-Not, белок Piwi и компоненты экспорта
РНК ................................................................................................................... 93
3.3. Митотические нарушения в раннем развитии на фоне нокдаунов Ccr4,
Not1, Woc и Trf2 в зародышевой линии .......................................................... 97
4
3.4. Ключевые киназы клеточного цикла Polo и Cdk1 взаимодействуют с
рибонуклеопротеидами HeT-A в оогенезе и раннем развитии Drosophila 102
3.5. Формирование рибонуклеопротеиновых комплексов, состоящих из
белка и РНК HeT-A, при гиперэкспрессии HeT-A, нарушает биогенез
центриолей в ходе оогенеза дрозофилы ........................................................ 105
3.6. Биогенез киназы Polo в оогенезе нарушен при гиперэкспрессии
теломерных повторов HeT-A ........................................................................... 108
3.7. Формирование HeT-A РНП приводит к нарушению первых
зиготических делений и ранней эмбриональной летальности .................... 111
4. ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................................... 115
4.1. Множество генетических факторов осуществляют негативный
контроль транскрипции теломерных повторов ............................................ 115
4.2. Теломерная РНК взаимодействует с белками клеточного цикла,
вызывая остановку развития ........................................................................... 119
4.3. Теломерная РНК как участник механизмов теломерного сигналинга
при дисфункции теломер ................................................................................ 124
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................. 126
6. ВЫВОДЫ ....................................................................................................... 127
7. БЛАГОДАРНОСТИ ........................................................................................ 128
Список литературы ............................................................................................. 130
