Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Филогения сумчатых и систематическое положение видов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana 12
1.2. Цитогенетика сумчатых 13
1.3. Феномен инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих 16
1.4. Структура, происхождение и эволюция центра инактивации X-хромосомы 17
1.4.1. Гены, входящие в состав центра инактивации и элементы, вовлеченные в регуляцию процесса инактивации у мыши и человека 17
1.4.2. Ген Xist и его роль в процессе случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы у плацентарных 20
1.4.3. Происхождение и эволюция генов центра инактивации 22
1.4.4. Видоспецифичность генов центра инактивации, кодирующих нетранслируемые РНК 23
1.5. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы 24
1.6. Гипотезы происхождения импринтированной инактивации X-хромосомы 26
1.7. Аутосомные гены с импринтированной моноаллельной экспрессией 30
1.7.1. Организация кластеров генов с импринтированной моноаллельной экспрессией 31
1.7.2. Импринтированная моноаллельная экспрессия и роль нкРНК в кластерах Ig/2r, Kcnql, Ig/2 32
1.7.3. Эпигенетические модификации при импринтированной моноаллельной экспрессии генов 38
1.7.4. Аутосомньте гены с импринтированной моноаллельной экспрессией у сумчатых 40
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Объект исследования 44
2.2. Работа с культурами клеток 44
2.2.1. Клеточные линии 44
2.2.2. Получение первичной культуры фибробластов лёгкого 44
2.2.3. Замораживание клеток 45
2.2.4. Размораживание клеток 45
2.3. Микробиологические методы работы 45
2.3.1. Приготовление компетентных клеток Е.coli 45
2.3.2. Трансформация 46
2. 4. Методы выделения ДНК 47
2.4. 1. Методы выделения геномной ДНК 47
2. 4. 2. Выделение ДНК ВАС-клонов 47
2. 4. 3. Метод выделения плазмидной ДНК 48
2. 5. Методики работы с ДНК 49
2. 5. 1. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 49
2. 5. 2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 49
2. 5. 3. Выделение фрагментов ДНК из гелей 50
2. 5. 4. Приготовление радиоактивно меченых зондов 50
2.5.5. Скрининг ВАС библиотек М. domestica и D. virginiana. 52
2.5.6. Анализ ДНК ВАС-клонов и геномной ДНК с помощью блот-гибридизации по Саузерну 52
2.5.7. Субклонирование фрагментов ДНК 53
2.5.8 Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 53
2. 5. 9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 54
2. 5. 10. Контекстный анализ последовательности ДНК 55
2 6. Методы работы с РНК 55
2.6.1. Выделение тотальной РНК из культур клеток 55
2.6.2. Синтез кДНК методом обратной транскрипции (RT) 56
2.7 Цитогенетические методы 57
2.7.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом 57
2.7.3. Приготовление зондов для флуоресцентной гибридизации in situ 57
2.7 4. Флуоресцентная гибридизация in situ 58
2.8. Выявление позднореплицирующегося хроматина 59
2.9. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом 59
Глава 3. Результаты и обсуждение 62
3.1. Получение зондов и скрининг ВАС-библиотек 62
3.2. Сравнительное картирование Х-хромосом опоссумов 63
3.2.1. Установление порядка генов 63
3.2.2. Изучение организации Х-хромосом опоссумов с помощью микродиссекционных проб 69
3.3. Построение и анализ контигов ВАС-клонов, окружающих гены Slcl6a2 и Chicl М. domestica и D. virginiana 68
3.4. Отсутствие прямого ортолога генаXist у опоссумов 75
3.5. Модификации хроматина Х-хромосом у сумчатых 76
3.5.1. Модификации, характерные для активного хроматина 77
3.5.2. Модификации, характерные для неактивного хроматина 82
3.5.3. Общие тенденции в распределении модификаций хроматина Х-хромосом у сумчатых 84
3.6. Механизмы инактивации Х-хромосомы у сумчатых и плацентарных млекопитающих отличаются и, вероятно, имеют независимое происхождение 90
Заключение 92
Выводы 94
Список литературы 95
